优化的反向PCR结合TAIL-PCR法克隆棉花线粒体atpA双拷贝基因及其侧翼序列

张晓，张锐，孙国清，史计，孟志刚，周焘，侯思宇，梁成真，于源华，郭三堆

1 中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京 100081

2 长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022

在分子生物学中，为更好地研究某个基因的结构和功能，往往需要克隆其侧翼序列。目前，已有多种技术用于扩增基因的侧翼序列[1-10]。但双拷贝基因侧翼序列的克隆仍是一个难点，因为难以确定所克隆到的序列是属于2个拷贝中的哪一个。以往要克隆双拷贝基因的侧翼序列，往往需要建立基因文库，然后筛选阳性克隆子进行测序，但这种方法费时费力。

棉花 Gossypium hirsutum L. 线粒体基因组中 atpA基因以双拷贝形式存在，该基因编码线粒体ATP酶复合体F1因子中的α亚基。研究发现，atpA基因在棉花细胞质雄性不育 (CMS) 系和保持系之间，以及棉花A、D基因组二倍体之间都存在明显的限制性片段长度多态性(RFLPs)[11-15]，这说明该基因是棉花线粒体基因组中的一个重组活跃位点，并很可能与棉花细胞质雄性不育相关。巩养仓[11]利用外源接头介导PCR法克隆到哈克尼西棉 CMS系及其保持系atpA基因的部分侧翼序列，但未能将棉花 atpA基因的2个拷贝区分开并加以详细解析。

为了克隆棉花双拷贝 atpA基因侧翼序列，我们将iPCR方法进行优化，并与TAIL-PCR相结合，摸索出一套高效简便的克隆双拷贝基因侧翼序列的方法。利用该方法，我们将 atpA两个拷贝进行了明确区分，并且获得的单条完整片段长达12 kb。结合实验结果，对该方法在扩增双拷贝甚至多拷贝基因侧翼序列中的应用进行了讨论。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

陆地棉CMS不育系P30A (不育胞质)、保持系P30B (可育胞质)、三系杂交种“银棉2号” (不育胞质)。P30A和P30B是同核异质系；P30A与“银棉2号”具有相同胞质。

1.1.2 菌株与质粒

大肠杆菌Escherichia coli TOP10感受态细胞购自北京博迈德生物技术公司；pGEMT-easy载体购自Promega公司。

1.1.3 试剂

Southern blotting检测试剂盒 (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ)购自 Roche公司；尼龙膜 Hybond-N+购自Amersham公司；凝胶回收试剂盒购自 Axygene公司；限制性内切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自北京天根生物公司；LA-Taq酶购自 TaKaRa公司；DNA ladder 0331购自Fermentas公司；其他化学试剂购自北京拜尔迪生物技术公司，均为分析纯。引物合成及DNA测序由上海生工生物工程技术服务公司完成。iPCR和TAIL-PCR所用引物如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 棉花总DNA提取

使用改良CTAB法[16]提取棉花CMS系、保持系、杂交种叶片总DNA。

1.2.2 棉花材料的Southern blotting分析

Southern blotting分析参考王教瑜等[17]的方法。

1.2.3 反向PCR (iPCR) 扩增atpA基因EcoRⅠ限制片段

参考Kim等[18]的方法并加以修改：取10 μg棉花总 DNA，在 200 μL酶切体系 (含 50 U EcoRⅠ酶) 中，37 ℃酶切6 h；用等体积苯酚：氯仿进行抽提，然后用无水乙醇沉淀。将 DNA用3 U的T4 DNA连接酶在300 μL体系中16 ℃连接24 h。然后，自连产物用等体积苯酚：氯仿进行抽提，然后用无水乙醇沉淀，20 μL双蒸水重溶。从中取500 ng DNA作为模板，用LA-Taq酶在50 μL体系中进行PCR反应。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，2 min，共35个循环；然后72 ℃延伸10 min。后续实验步骤参照分子克隆实验手册[19]。扩增产物用 0.9%琼脂糖凝胶进行电泳，回收纯化目的片段，连接到pGEMT-easy载体，然后转化E. coli TOP10感受态细胞，将阳性质粒送上海生工生物工程技术服务公司测序。

1.2.4 TAIL-PCR扩增atpA基因Hind Ⅲ限制片段

具体方法参见文献[20]。简并引物选用AD10 (表1)；采用50 μL PCR体系；从第一步 (Primary)和第二步 (Secondary) 反应液中取 0.5 μL作为各自下一步的模板。具体反应步骤如表2所示。

2 结果与分析

2.1 atpA基因在陆地棉CMS不育胞质和可育胞质间存在明显的RFLPs

以atpA核心编码区 (引物为P1和P2，图3所示) 为探针，对陆地棉细胞质雄性不育系P30A、保持系P30B、三系杂交种“银棉2号”进行Southern blotting分析。结果表明，可育胞质 (保持系) 和不育胞质 (不育系和杂交种) 间存在明显的RFLP多态性：用EcoRⅠ酶切时，可育胞质出现2.2 kb和5.1 kb两条杂交带，而不育胞质的杂交带是2.2 kb和3.3 kb；用Hind Ⅲ酶切时，可育胞质出现8.5 kb和11.6 kb两条杂交带，而不育胞质的杂交带是9.1 kb和11.6 kb。这表明，陆地棉可育胞质和不育胞质在 atpA位点存在明显差异。所以，如果能克隆到 atpA基因所在的EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制片段，对研究棉花胞质雄性不育机理将很有意义。

表1 本实验所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

表2 TAIL-PCR反应条件Table 2 Cycling conditions of TAIL-PCR

图1 atpA基因为探针的Southern blotting杂交结果Fig. 1 Southern blotting analysis of total DNA from CMS line P30A (1), maintainer line P30B (2) and hybrid cultivar “Yinmian 2” (3) hybridized with atpA probe. Polymorphic bands between the fertile cytoplasm (2) and sterile cytoplasm (1, 3) are indicated by arrows.

2.2 iPCR法扩增atpA基因EcoRⅠ限制片段

根据atpA基因编码序列设计iPCR所需的两对反向引物：P4和P5，P3和P6。P4和P5分别对应atpA编码区的258~285 bp和1 098~1 125 bp，二者相距812 bp；P3和P6分别对应atpA编码区的140~167 bp和1 183~1 210 bp，相距1 015 bp (表1和图3)。首先按照常规的iPCR方法：先用P4和P5为引物，以100 ng自连产物为模板进行一次iPCR (1st iPCR)，然后用P3和P6为引物，以“1st iPCR”产物为模板进行巢式PCR (“2nd iPCR”)。结果发现，在P30A中“1st iPCR”可以扩增出相应条带，但亮度很弱；“2nd iPCR”时目的条带未获得富集反而亮度更淡。在 P30B中，“1st iPCR”可以将2.2 kb Southern blotting杂交片段所对应的条带扩增出来，但无法扩增出5.1 kb杂交片段所对应的条带；“2nd iPCR”时目的条带未获得富集反而亮度更淡 (图 2B)。然后，我们参照Kim等的方法[18]，将自连条件改为37 ℃，2 h，PCR模板量增大到500 ng进行iPCR。结果发现可以将图2A中杂交片段所对应的条带都扩增出来，但是亮度偏弱 (图 2C)，很难进行回收克隆，这说明连接时间太短会明显降低环化效果。

所以，我们对iPCR技术在2个方面进行了优化，以保证通过一次PCR反应就能获得足够的目的产物。一是自连时间延长到 24 h以上(16 ℃)，以获得足够的目的环化 DNA；二是将PCR的起始模板量增大到500 ng，以保证目标产物获得高效扩增。结果从不育胞质线粒体基因组中扩增出1.2 kb和2.3 kb两条带，分别对应2.2 kb和3.3 kb EcoRⅠ限制片段；从可育胞质线粒体基因组中扩增出1.2 kb和4.1 kb两条带，分别对应2.2 kb和5.1 kb EcoRⅠ限制片段 (图2 D)。

将上述片段分别克隆测序后与 atpA基因核心保守序列进行拼接还原，发现 atpA基因在不育胞质和可育胞质线粒体基因组中各有两个不同的拷贝，如图3所示。

可育胞质中2条EcoRⅠ限制片段的长度是2 225 bp和5 083 bp，分别命名为N-1和N-2，二者5′端的EcoRⅠ位点相同，都是位于atpA基因编码序列的第4 bp处 (ATGG AATTC)。N-1中含有完整atpA基因 (需要加上EcoRⅠ酶切位点上游的4个碱基ATGG)，长度1 524 bp，编码507 aa。N-2中含有截短型atpA基因，截断位点位于编码区第1 352 bp处。不育胞质中相应的两条EcoRⅠ限制片段分别命名为S-1 (2 194 bp)和S-2 (3 297 bp)。S-1中含有完整atpA基因；S-2中含有3′截短型基因，截断位点位于编码区第1 336 bp处。

iPCR结果中，可育胞质除1.2 kb和4.1 kb两条目的带之外，还存在一条 2.5 kb和一条0.3 kb的条带。克隆测序结果表明，二者分别由N-2中3 599 bp处 (GAATT T) 和1 327 bp处(A AATTC) 的 EcoRⅠ星号活性产生。同样，不育胞质0.35 kb条带是由S-2中1 369 bp处(GAATT T) 的星号活性产生。

为验证所克隆到的 EcoRⅠ限制片段是否正确，我们根据片段两端序列设计引物：P7结合P8扩增N-1和S-1，P7结合P9和P10来分别扩增 N-2和 S-2。结果扩增出与 Southern blotting结果相符的条带 (图4)。证明iPCR法成功将棉花线粒体atpA基因2个不同拷贝进行正确区分。

2.3 TAIL-PCR扩增atpA Hind Ⅲ限制片段

atpA基因EcoR Ⅰ限制片段的大小在2.2~ 5.1 kb之间，Hind Ⅲ限制片段的大小在8.5~11.6 kb之间，这说明前者总体上只是后者的一部分。为进一步解析后者的多态性，我们在前者的基础上，采用TAIL-PCR方法，进一步克隆atpA的侧翼序列。分析发现，前者4条片段中只在N-2的第4 143 bp处发现一个Hind Ⅲ位点。所以，要获得后者的4条片段，需要以前者片段为核心，分别向上、下游进行基因组步移 (TAIL-PCR)，理论上共需要向7个方向进行，即：N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游和N-1、S-1、S-2片段的3′下游。进一步分析发现4条EcoR Ⅰ限制片段的5′末端都是相同的，且先前对atpA基因 5′上游进行TAIL-PCR时发现，两种胞质TAIL-PCR扩增条带是相同的，这说明两种胞质atpA基因的 5′上游序列基本一致。所以，“N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游”这四者的基因组步移工作可以简化成其中之一。同样，“N-1、S-1片段的3′下游”这两者的基因组步移工作也简化成其中之一。这样，7个步移任务简化成 3个：S-1片段的 5′上游和 3′下游、S-2片段的3′下游。

图2 atpA基因的Southern blotting (EcoR Ⅰ酶切) 及反向PCR结果Fig. 2 Southern blotting and iPCR results of atpA gene. (A) Southern blotting analysis of atpA probe (EcoR I digested). (B, C, D) Results of iPCR with atpA-specific primer pairs. M: DNA marker; S: P30A; N: P30B; asterisks (*) indicate the bands resulted from star activity of EcoR I.

图3 陆地棉可育胞质和不育胞质中atpA基因EcoRⅠ限制片段示意图Fig. 3 Schematic structures of all EcoR Ⅰ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm. The atpA coding sequences are indicated by gray boxes. The 3′ identical noncoding regions in N-1 and S-1 are represented by open bars. The deletion of the sequences at the SSR loci located downstream of the full-length atpA gene in S-1 is shown in hatched bars. The truncated regions of N-2 and S-2 are indicated by different cross-hatched bars. The 3′identical regions in N-2 and S-2 following the truncated regions are represented by hatched bars. P1 and P2 indicate the primers used for amplifying the core sequence of atpA for Southern blotting. P3-P6 indicate the primers used for inverse PCR. P7-P10 indicate the primer used for amplifying the EcoR Ⅰ restriction fragments ofatpA. Pentagrams indicate the sites that show star activity of EcoRⅠ.

图4 克隆片段的PCR鉴定Fig. 4 Identification of the cloning fragments by PCR. M: generuler 0331 marker; four primer pairs (P7/P8, P7/P8, P7/P10, and P7/P9) were used to amplify fragments of S-1, N-1, S-2, and N-2, respectively.

2.3.1 atpA基因5′上游区的基因组步移

我们以P30A总DNA为模板，向atpA 5′上游进行了两轮 TAIL-PCR (图 5A)，第Ⅰ轮TAIL-PCR的3步反应中使用的特异引物分别为R1、R2、R3；第Ⅱ轮使用的引物分别为R4、R5、R6 (表1，图6)。通过两轮PCR反应，共获得了4 837 bp的侧翼序列，在atpA起始密码子5′上游4 351 bp处发现了Hind Ⅲ酶切位点。

为验证这段4 351 bp序列是否为4个片段(N-1、S-1、N-2、S-2) 所共有，我们在该序列的5′端设计引物P11，在全长atpA编码区3′末端设计引物P12，在N-2和S-2 atpA编码区截短位点后分别设计引物P13 和P14 (表1，图6)，分别以P30A或P30B总DNA为模板进行PCR扩增，获得了与预期相符的条带 (数据未显示)，测序结果证明该序列是4个片段所共有。

2.3.2 atpA全长拷贝3′下游区的基因组步移

以P30A总DNA为模板，向S-1 3′下游进行了两轮TAIL-PCR (图5 B)，两轮反应所使用的特异引物分别是F1、F2、F3; F4、F5、F6 (表1，图6)。结果共获得5 509 bp侧翼序列，其中在S-1下游5 109 bp处发现了Hind Ⅲ位点。为验证所获序列是否正确，我们在全长 atpA编码区3′末端设计引物P15，在5 509 bp序列3′端设计引物P16，分别以P30A或P30B总DNA为模板进行 PCR扩增，结果获得了与预期相符的条带(数据未显示)，测序结果证明该序列是S-1和N-1所共有。

2.3.3 不育胞质截短型 atpA拷贝 (S-2) 3′下游区的基因组步移

以P30A总DNA为模板，以SF1、SF2、SF3 (表1，图6) 为特异引物，向S-2下游进行了一轮TAIL-PCR (图5 C)，获得了3 369 bp侧翼序列，其中在第1 482 bp处，发现了Hind Ⅲ位点。为验证正确与否，我们在S-2 atpA编码区截短位点及所获序列 3′末端处分别设计引物 P17和 P18 (表1，图6)，以P30A总DNA为模板进行PCR扩增，结果获得了与预期相符的条带 (图片未显示)。

图5 不育胞质atpA基因侧翼序列 TAIL-PCR结果Fig. 5 TAIL-PCR results of flanking sequences of atpA in CMS line. (A) TAIL-PCR results of 5′ flanking sequences of atpA in CMS line. (B) TAIL-PCR results of 3′ flanking sequences of intact atpA gene in CMS line. (C) TAIL-PCR results of 3′flanking sequences of truncated atpA gene in CMS line. M: generuler 0331 marker; 1, 2, and 3 indicate the primary, secondary and tertiary reaction of TAIL-PCR (Table 2); I and II indicate the first and second round of TAIL-PCR.

图6 棉花可育胞质和不育胞质中atpA基因Hind Ⅲ限制片段示意图Fig. 6 Schematic structures of all Hind Ⅲ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm of cotton. The 5′ identical regions in N-1, N-2, S-1 and S-2 are represented by dotted bars. The 3′ identical regions in N-1 and S-1 following the atpA coding regions are represented by open bars. The differential sequences near 3′ Hind Ⅲ sites in N-2 and S-2 are indicated by different hatched bars. F1-F6, R1-R6, SF1-SF3 indicate the primers used for TAIL-PCR. P11-P14 indicate the primers used for amplifying 5′ flanking and coding regions of atpA; P15-P18 indicate the primers used for amplifying 3′ flanking regions of atpA.

通过以上TAIL-PCR反应，获得了棉花线粒体atpA基因EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ酶切位点之间的序列 (图6)，发现了两种胞质间新的差异序列，并确定了可育胞质和不育胞质中两条Hind Ⅲ限制片段长度分别是11 689 bp和8 501 bp；11 658 bp和9 139 bp。

综上所述，通过iPCR和TAIL-PCR相结合的方法，我们获得了陆地棉可育胞质和不育胞质atpA基因所有的EcoR Ⅰ限制片段和Hind Ⅲ限制片段，将该基因的2个拷贝进行了明确区分，确定了导致RFLP多态性的序列，在两种胞质中各获得了超过20 kb的线粒体DNA序列，这些序列将有助于研究棉花 CMS机理及开发 CMS相关分子标记。

3 讨论

通过优化的iPCR和TAIL-PCR相结合的方法，我们获得了陆地棉可育胞质和不育胞质线粒体双拷贝 atpA基因每个拷贝各自的侧翼序列，证明可育胞质和不育胞质中各有一个全长拷贝和一个3′截短型拷贝，但3′截断的位置不同。分析发现，在atpA编码区存在一个BamH Ⅰ位点(图3)，这解释了为何在BamH Ⅰ酶切产物中atpA显示出4条杂交条带[14]。将我们的结果与巩养仓的结果[11]进行比较发现，巩养仓所获得的 atpA侧翼序列属于 3′截短型拷贝。iPCR方法具有较高的灵敏性，我们不只扩增出目的条带，同时也扩增出由 EcoRⅠ酶星号活性所产生的条带。我们在对atpA基因进行Southern blotting实验过程中发现，如果酶切产物上样量较大，就很容易出现一些弱杂交带。通过iPCR方法便明确了这些弱杂交带通常是由内切酶的星号活性产生的。所以，iPCR技术还可以用来鉴别某个基因Southern blotting的杂交信号中哪些是真拷贝，哪些是假拷贝。

iPCR在扩增基因侧翼序列方面的优势就是它可以通过一个PCR反应同时扩增出5′和3′侧翼序列，并且它可以在一个反应中扩增出多拷贝基因的侧翼序列并加以区分，这是其他染色体步移方法很难做到的。传统的iPCR需要连续进行二步PCR反应，我们用一步PCR就扩增出信号很强的条带，关键因素之一就是加大iPCR反应的起始模板量，本实验所用的模板量在500 ng以上。自连效率是iPCR成功的关键因素，由于连接体系中要求DNA浓度不能太高，为获得产量较高的自连产物，需要适当加大自连体系，并延长连接时间。我们利用优化的 iPCR方法还成功克隆到棉花线粒体atp9、nad6、nad7基因的侧翼序列 (未发表)，表明该方法重复性较好。利用获得的差异序列，我们已将棉花可育胞质和不育胞质之间的RFLP标记转化成SCAR和SSR标记，说明该方法在分子标记开发中也具有很大的潜力。

从图2可看出，优化后的iPCR法不仅可以扩增出目的条带，而且可以将星号活性位点产生的片段也扩增出来：在P30A中，共扩增出了3条带；在P30B中，共扩增出了4条带。这说明只要酶切产生的线性片段具有互补的粘性末端，并且长度不是过长 (超过5 kb)，就可以自连环化并进而被有效扩增。所以，优化后的iPCR方法不仅可以克隆双拷贝基因的侧翼序列，而且也可以扩增多拷贝基因的侧翼序列。

iPCR法对于片段自连效果要求高，如果一个限制片段很长，就很难有效连接并扩增。一般来说，在进行iPCR反应之前，先要进行Southern blotting分析，以确定一种能获得合适长度杂交片段的限制性内切酶。棉花atpA/EcoRⅠ限制片段的大小是2.2~5.1 kb，长度比较合适。但是Hind Ⅲ限制片段长达11.7 kb，需要借助TAIL-PCR方法。TAIL-PCR方法不受限制片段长度的束缚，只要控制好方向，它理论上可以无限地往侧翼方向扩增延伸。在进行TAIL-PCR实验时，我们使用了LA-Taq酶，该酶具有很强的扩增能力，我们进行了多轮TAIL-PCR反应，基本上每轮都能获得2~3 kb的目的条带。

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