柑橘黄龙病侵染相关抗病基因同源序列的克隆鉴定与表达分析

刘婷婷， 殷幼平， 林亚玉， 贤家旭， 陈世伟， 王中康＊

（1．重庆大学生物工程学院基因研究中心，重庆 400030；2．广西利添生物科技发展 （合浦）有限公司，北海 536128）

柑橘黄龙病 （Citrus Huanglongbing，HLB）是影响世界柑橘产业的一种毁灭性病害［1］。该病害至今未能得到稳定的纯培养，妨碍了病害侵染机理的深入研 究［2］。Jeong－Soon Ki m［3］、Ute Albrecht［4］用生物芯片技术对柑橘染病后体内的基因表达进行了研究，从分子角度对柑橘被黄龙病菌侵染后的反应进行了分析。利用寄主抗病性是防治病害的一种经济有效的方法，国际对于柑橘的分子抗性育种也正在研究中［5］，但尚未有商用的抗性品种问世。依据现有的研究报道及田间观察，发现长期生长在柑橘黄龙病病区的多年生柚树（10～30年）病害症状不明显，对黄龙病呈现一定程度的耐病性，是抗黄龙病育种的潜在的基因资源，因此可以由此入手分析其抗病相关基因的特性。迄今为止，已经分离鉴定出约50余种抗病基因［6］，通过对这些基因进行分析，发现其表达产物具有特定的保守结构域，如核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）、亮氨酸重复序列（leucine－rich repeat，LRR）、丝氨酸／苏氨酸蛋 白 激酶（serine－threonine kinase，STK）等［7－8］。根据已知抗病基因表达产物的保守区域设计简并引物PCR扩增得到的序列称为抗病基因同源序列（resistance gene analogs，RGAs），目前通过该方法已经从甘蔗［9］、姜［10］、杏［11］、大豆［12］、小麦［13］等植物中扩增得到了大量RGAs。但是从基因组中得到的RGA可能有不表达的假基因，而从c DNA中分离的RGA则一般都是表达序列［14］，通过对已克隆RGA的分析，并不是所有的RGA都与抗病基因相关，因此需要对得到的RGA进行抗病相关性的分析和鉴别以确定抗病相关基因。……