链霉菌182－2抗真菌活性物质的分离及抑菌特性的初步研究

高 芬， 卢赛飞， 王梦亮

（山西大学应用化学研究所，太原 030006）

植物病原真菌是危害农作物的主要病原微生物类群，给农业生产造成巨大的损失［1］。目前，化学农药在控制植物病害造成的损失上仍起着主要作用。但是化学农药的大量使用，已经对人类环境造成了严重的危害，并且增加了病害的抗药性［2］。从天然资源中寻找活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化合物保护作物已成为当前研究的重点［3］。链霉菌182－2（Streptomyces sp．182－2）产生一种抗真菌抗生素，其发酵液具有较广的抗菌谱，生物活性明确、高效，具有开发为工业化产品的价值，所以有必要对其进行分离纯化。由于该抗菌活性组分具有水溶性好的特点，用一般的有机溶剂萃取的方法不能从发酵液中将其有效地提取出来［4］。而用大孔吸附树脂提取抗生素多有报道，且此方法具有吸附容量大、吸附速度快、易解吸、易再生等优点［5－6］，所以本试验采用的方法为活性炭脱色、大孔吸附树脂柱层析纯化等方法对链霉菌182－2产生的抗真菌活性物质进行了初步纯化，并对其抑菌特性进行了初步研究。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 供试菌株

链霉菌182－2菌株由本实验室保存；烟草赤星病菌［Alter naria alter nata （Fries）Keissler］由中国农业科学院烟草研究所惠赠。

1．1．2 主要仪器和材料

仪器：DHL－A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）。电脑自动部分收集器DBS－100（上海青浦沪西仪器厂）。HD－9704紫外检测仪（上海精科实业有限公司）。

试剂：大孔吸附树脂：X－5、H103、AB－8购自南开大学化工厂，XAD16、XAD7购自北京慧德易。活性炭：购自新华活性炭厂。

1．2 发酵液的预处理

发酵液用草酸（0．5 mol／L）调p H3．0，60℃保温30 min，然后6 000 r／min离心10 min沉降，取上清液加入等量预冷丙酮，混合均匀后，将混合液在水浴中缓缓加热至50℃，维持10 min，冷却至室温，再次6 000 r／min离心10 min去除沉淀，上清旋转蒸发去掉丙酮［4］。

1．3 抑菌活性测定方法

采用牛津杯法［7］。将活化的烟草赤星病菌制成孢子悬液（10×15倍下，10～20个／视野），吸取300μL加入70 mL熔融态PDA培养基，制成混菌平板。等距离放置牛津杯，用移液枪往每个牛津杯中加200μL粗提液，28℃恒温培养48 h后十字交叉法测量抑菌圈直径，下面所有抑菌试验均设3次重复，以无菌蒸馏水为对照。

1．4 活性炭吸附法纯化抗菌活性物质

1．4．2 活性炭的筛选

称取处理好的1．5 mm柱状活性炭、4 mm柱状活性炭、粉末状活性炭和颗粒状活性炭各1 g，放入三角瓶中，加预处理的发酵液4 mL，摇床上振摇4 h（220 r／min，28℃）。测吸附余液抑菌活性。

1．4．2 洗脱剂及浓度的选择

取吸附后的1．5 mm柱状活性炭平均分装于4个三角瓶中，分别加入50%、60%和70%的丙酮，及80%乙醇各4 mL，摇床上振摇4 h（220 r／min，28℃）。测洗脱液抑菌活性。

1．4．3 1．5 mm柱状活性炭纯化抗菌活性物质

依据上述试验筛选的条件，取1．5 mm柱状活性炭50 g，放入三角瓶中，加100 mL预处理的发酵液，摇床上振摇4 h（220 r／min，28℃）。吸附完后用等体积的50%的丙酮洗脱，摇床上振摇4 h（220 r／min，28℃）。测量洗脱液抑菌活性，并旋转蒸发，冷冻干燥。

1．4．4 活性炭脱色效果的测定

将经活性炭处理过的抗菌活性物质稀释成不同浓度，在480 nm处测吸光值，对其进行线性回归，得回归方程y＝0．049 9x＋0．034 8，r2＝0．998 9，线性关系良好。于480 nm处测定粗提液吸收值，以吸光度值表示溶液色度的大小。依据公式：脱色率＝（脱色前色度－脱色后色度）／脱色前色度×100%，计算脱色率［8］。

1．5 大孔树脂吸附法纯化抗菌活性物质

1．5．1 树脂的筛选

取经过预处理的大孔吸附树脂H103、X－5、AB－8、XAD7、XAD16各1 g，放入三角瓶中，分别加入6 mL的2 mg／mL的粗提液，摇床上振摇4 h（220 r／min，28℃），测吸附余液活性。

1．5．2 洗脱剂的筛选

将吸附后的H103树脂倾去余液，平均置于6个三角瓶中，加入50%、80%甲醇；50%、75%乙醇；50%、75%丙酮各6 mL，摇床上振摇4 h（220 r／min，28℃），测洗脱液抑菌活性。

1．5．3 洗脱流速对洗脱效果的影响

用吸附饱和的大孔吸附树脂H103制备层析柱3根（2．0 c m×40 c m），然后用50%的丙酮160 mL洗脱，流速分别为1．0、1．5、2．0 mL／min，流出液每4 mL收集一管。分别测定各管收集液在254 n m下的紫外吸收值。

1．5．4 H103树脂柱层析纯化抗菌活性物质

H103树脂经过预处理后装柱（2．0 c m×40 c m），3倍体积去离子水平衡。上样20 mL（浓度2 mg／mL），流速0．5 mL／min。上样完毕，用去离子水80 mL快速冲洗未完全吸附的活性物质后，50%的丙酮洗脱，洗脱体积160 mL，流速1．0 mL／min。分部收集洗脱液，4 mL／管。紫外吸收法和牛津杯法分别检测每管洗脱液的紫外吸收和抑菌活性，并绘制洗脱曲线。合并同一洗脱峰中活性高的洗脱液，并将合并液旋转蒸发，冷冻干燥。

1．6 抗菌活性物质对烟草赤星病菌的作用方式

1．6．1 对烟草赤星病菌的抑制作用

将烟草赤星病菌的孢子（10×15倍下，10～20个孢子每视野）制成混菌平板，混菌平板制作同1．3。分别加入经H103树脂纯化后的活性物质，使其终浓度分别为125、250、500、1 000μg／mL和2 000μg／mL，做抑菌活性测定，并在显微镜下观察菌丝形态变化。

1．6．2 对烟草赤星病菌的抗生作用

将300μL烟草赤星病菌孢子液（10×15倍下，10～20个孢子每视野）加入30 mL PD培养液中，28℃恒温培养24 h至长出均匀可见菌丝后，将活性物质加入培养液，使其终浓度分别为10、20、40、80、160μg／mL和320μg／mL。继续培养24 h，肉眼观察未见菌丝生长的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。然后将菌丝捞出，无菌水充分冲洗，重新放入未加活性物质的PD培养液30 mL中，再培养48 h，肉眼观察未见菌丝生长的最低浓度为最小杀菌浓度（MBC）［9］。

1．6．3 对烟草赤星病菌菌丝生长速率的影响

将活性物质加入定量装好的熔融态PDA培养基内，使其终浓度为6．25、12．5、25、50、100μg／mL和200μg／mL，制成含毒平板，再将培养7 d的病菌制成菌饼（直径6 mm），接入含毒平板中央，28℃恒温培养。于24、48、72 h时十字交叉法测菌饼的生长情况。计算抑制率和抑菌中浓度（EC50）［10－11］。

1．6．4 对烟草赤星病菌孢子萌发的影响

将活性物质分别配制成一定浓度溶液，取配好的药液5 mL与孢子悬浮液（20～40个／视野）等体积混合后，使活性物质终浓度分别为6．25、12．5、25、50、100μg／mL和200μg／mL，加入无菌平皿，28℃恒温培养。24、48、72 h时观察孢子萌发情况。拍照观察孢子形态。计算孢子萌发抑制率和抑菌中浓度EC［10－11］50。

上述试验均以无菌蒸馏水为对照，设3次重复。

2 结果与分析

2．1 发酵液的预处理

发酵液经草酸酸化和丙酮沉淀两步去除了杂蛋白和其他杂质，牛津杯法测定抑菌活性后，抑菌圈直径可达38．4 mm。

2．2 活性炭吸附法纯化抗菌活性物质条件的筛选

2．2．1 活性炭的筛选

吸附余液的抑菌试验结果显示：用1．5 mm柱状活性炭处理后，吸附余液的抑菌圈直径最小，用粉末状活性炭处理后的吸附余液抑菌圈最大（图1）。说明1．5 mm柱状活性炭对该活性物质的吸附能力最强。因此，选用1．5 mm柱状活性炭进行下步试验。

图1 经不同活性炭处理后吸附余液的抑菌活性

2．2．2 洗脱剂及浓度的选择

洗脱剂的选择结果如图2所示，1．5 mm柱状活性炭经50%丙酮、60%丙酮和80%乙醇洗脱后，50%丙酮的洗脱液抑菌活性最强，可达35．0 mm。同时发现，50%丙酮的洗脱液颜色最浅，只有轻微的黄色，可见在这一洗脱条件下，抑菌活性物质被较好地洗脱下来，而色素洗脱下来很少。

图2 不同洗脱剂洗脱能力的对比

2．2．3 1．5 mm柱状活性炭纯化抗菌活性物质

经活性炭纯化后的抗菌活性物质，抑菌圈直径可达到38 mm。且脱色效果明显，未经处理的活性物质粗提液，颜色为深黄色，经过处理的活性物质液体较透明澄清，脱色率可达77%。

2．3 大孔树脂吸附法纯化抗菌活性物质

2．3．1 树脂的选择

树脂筛选结果如图3所示，用H103树脂处理过的吸附余液的剩余活性最小，而XAD7树脂处理过的吸附余液活性最大，这说明H103对该活性物质的吸附能力最强。因此，选用H103树脂为试验用的树脂。

图3 经不同树脂处理后吸附余液的抑菌活性

2．3．2 洗脱剂的选择

大孔树脂吸附活性物质后，用不同溶剂系统洗脱，50%丙酮的洗脱液抑菌活性最大（图4），说明该溶剂系统可以把活性物质从树脂上很好地洗脱下来，因此选择50%丙酮作为大孔树脂吸附后的洗脱剂。

图4 不同洗脱剂洗脱能力的对比

2．3．3 洗脱流速对洗脱效果的影响

由图5可知，洗脱流速对分离效果有一定的影响，洗脱流速为2 mL／min时，洗脱曲线峰形较宽，且伴随一定程度的拖尾现象，不利于纯化。当流速为1 mL／min时，洗脱峰形最窄，洗脱成分相对集中，样品较好地进行分离。所以本试验选择洗脱流速为1 mL／min。

图5 洗脱流速对洗脱效果的影响

2．3．4 H103树脂柱层析纯化抗菌活性物质

按上述选择条件进行H103柱层析，以每管收集馏分的抑菌活性和在254 n m下的紫外吸收为检测指标，在50%丙酮洗脱下均得到2个洗脱峰（图6），推测至少含有2个活性组分。由于洗脱峰Ⅰ抑菌活性小，且收集量较少，因此主要收集洗脱峰Ⅱ为下步研究对象。

图6 大孔树脂吸附法纯化抗菌活性物质的洗脱曲线

2．4 抗菌活性物质对烟草赤星病菌的作用方式

2．4．1 对烟草赤星病菌的抑制作用

活性物质的浓度为125μg／mL时，抑菌圈直径只有13 mm，随着其浓度的增大，抑菌圈直径逐渐增大。当活性物质的浓度为2 000μg／mL时，对烟草赤星病菌的抑菌圈直径可达58 mm。挑取这部分菌丝显微观察发现：菌丝颜色加深、节间缩短、变形扭曲并且产生大量泡囊，而对照菌丝生长光滑纤细（图7）。

图7 抗菌活性物质对烟草赤星病菌的抑菌作用（400×）

2．4．2 对烟草赤星病菌的抗生作用

试验结果表明，当活性物质浓度为80μg／mL时，24 h后菌丝未见生长。且随着活性物质浓度增大，变黑的菌丝逐渐增多。将不再生长的菌丝洗去黏附的抗菌活性物质后，加入不含活性物质的PD培养液中继续培养48 h，活性物质浓度为160μg／mL，处理过的菌丝没有生长，所以该抗菌活性物质的 MIC为80μg／mL，MBC为160μg／mL。

2．4．3 对烟草赤星病菌菌丝生长速率的影响

活性物质对烟草赤星病菌菌丝生长有明显的抑制作用。在相同时间下，抑菌作用随活性物质浓度的增大而增强；在同一浓度下，48 h时抑制率达到最高，EC50为31．9μg／mL。随时间的延长，抑制率开始呈降低的趋势（表1）。

表1 抗菌活性物质对烟草赤星病菌菌丝生长速率的影响

2．4．4 对烟草赤星病菌孢子萌发的影响

抗菌活性物质对烟草赤星病菌孢子萌发有明显的抑制作用，在不同时间段内，抑制率随浓度的增大而增大；同一浓度下，48 h时抑制率达到最高，EC50为42．2μg／mL，之后开始下降（表2）。显微镜观测显示：对照的孢子光滑饱满，萌发出光滑、细长的菌丝。处理的孢子则表面粗糙、甚至变形，萌发出的芽管受到了不同程度的抑制，有的刚萌发即形成大泡囊；当活性物质浓度为200μg／mL时，出现孢子破裂、原生质体凝集渗漏现象（图8）。

表2 抗菌活性物质对烟草赤星病菌孢子萌发的抑制作用

图8 抗菌活性物质对烟草赤星病菌孢子萌发的抑制作用（400×）

3 结果与讨论

链霉菌182－2发酵液中抗真菌活性组分的抗菌谱较广，对烟草赤星、番茄早疫和苹果斑点落叶等病原菌有明显的抑制作用，具有较好的工业应用价值。针对该抗菌活性物质的理化性质［12］，我们选择了活性炭脱色法和大孔树脂吸附法的粗分离［13－14］。结果表明1．5 mm 柱状活性炭 具 有 较 好的脱色作用，且起到了一定的纯化作用。H103大孔吸附树脂对此活性物质进行分离时，分离效果较好，去掉了大部分的杂质，得到两个活性峰，说明该抗菌活性物质至少有两个活性组分。由于活性峰Ⅰ抑菌活性较弱（这可能与收集到的量较少有关系），所以我们选择活性峰Ⅱ收集，并进行抑菌作用方式的研究。

在离体条件下，采用抑制菌丝生长速率法和抑制孢子萌发等方法表明纯化后的活性物质对烟草赤星病原菌具有较强的抑制作用。对该抗菌物质进一步纯化以及结构的研究正在进行中，相信该抗菌活性物质会有很好的发展前景。

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