当归内生真菌抗植物病原菌的活性研究

江 曙， 段金廒， 钱大玮， 陶金华

（1．南京中医药大学药学院，南京 210046； 2．南通大学医学院，南通 226019）

内生真菌是指在植物体内完成其生活史的部分或全部，生长于植物组织细胞间，分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根中，但又不引起任何病症的微生物，突出强调了内生真菌与植物的互惠共生关系［1］。Selosse等研究表明，被内生真菌感染的植物遭受到真菌病害影响的程度远远低于没有感染内生真菌的植物［2］。由此可见，内生真菌可提高宿主植物对生物胁迫的抵抗能力［3］。

近年来的研究表明，内生真菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，能够产生一些结构新颖、类型多样的次生代谢产物，如萜类、生物碱类、芳香类、肽类等化合物，具有较强的抑菌、杀菌活性［4－6］，是临床抗菌药物和生物农药研究与开发的潜在资源，在农业和医药领域具有重要的应用前景。目前关于药用植物内生真菌抗菌活性的研究较少，当归内生真菌的研究还未见相关报道，本文主要研究当归内生真菌及其代谢产物的抗菌活性，为进一步寻找天然活性物质及生物农药提供依据，为植物病原真菌的生物防治以及发展绿色中药材探索新的途径。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 供试菌株

当归内生真菌（分离自当归新鲜植株），小麦赤霉病菌（Fusariu m gr a minear u m Sch w．），番茄早疫病菌（Alter naria sol ani），番茄灰霉病菌（Botr ytis cinerea），水稻纹枯病菌（Rhizoctonia sol ani），南京中医药大学生物制药教研室保藏。

1．1．2 培养基

PDA培养基［7］；内生真菌发酵培养基：葡萄糖1%，黄豆饼粉2%，淀粉1%，MySO4·7 H2O 0．3%，KH2PO40．3%，NH4Cl 0．3%，自然p H，121℃灭菌30 min。

1．1．3 仪器与设备

高速离心机（TGL－6B，上海安亭科学仪器厂），微量移液器（QYQ，北京金花），旋转蒸发仪（RE－52A，上海亚荣生化仪器厂）。

1．2 方法

1．2．1 内生真菌的活化

将4℃冰箱中保藏的内生真菌接种到新鲜的PDA斜面上，于28℃培养6～7 d。

1．2．2 内生真菌的发酵及样品处理

分别挑取内生真菌菌块接种到含有40 mL发酵培养基的150 mL三角瓶中，于28℃，200 r／min培养5 d。发酵结束后，10 000 r／min离心10 min，上清液于60℃减压浓缩至4．0 mL，经细菌过滤器过滤后，得无菌浓缩液。

1．2．3 抗植物病原真菌活性的测定［8－9］

1．2．3．1 拮抗试验

挑取直径为6 mm的小块植物病原真菌接种于PDA平板的中央，然后将不同的内生真菌（直径6 mm）接种在平板四周，于28℃培养6 d，根据抑菌圈的有无及大小判断是否存在拮抗作用以及拮抗作用的强弱。

1．2．3．2 抑制菌丝生长法

将无菌浓缩液1 mL与9 mL融化的PDA培养基混匀，倒入无菌培养皿中制成带药培养基平板。培养基凝固后，放入1个供试菌的菌饼（直径为6 mm），使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，重复3次。对照为取1 mL的无菌水与9 mL融化的PDA培养基混匀，其他操作同处理组一致。培养72～96 h后，按下列公式计算抑制率。

菌丝生长抑制率＝（对照菌落直径－处理菌落直径）／（对照菌落直径－6）×100%。

1．2．3．3 抑制孢子萌发法

取供试植物病原真菌的孢子配成适当浓度的孢子悬浮液，在10×10低倍镜观察，每个视野有30～40个孢子。将1 mL无菌浓缩液与1 mL孢子悬浮液混合，取1滴滴加在凹玻片上，每处理重复3次。对照为将1 mL的无菌水与1 mL孢子悬浮液混合，其他操作同处理组一致。在25℃下保湿培养，当对照的萌发率达到80%后，检查所有处理的萌发率。以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发。在小麦赤霉病菌孢子液中添加当归内生真菌提取物后，培养至8 h，而其他3种病原真菌孢子的处理组均培养至10 h后，按下式计算孢子萌发抑制率：

萌发抑制率＝（对照萌发率－处理萌发率）／对照萌发率×100%。

2 结果与分析

2．1 拮抗菌株的初步筛选

将分离于当归新鲜植株的206株内生真菌分别进行对小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌和水稻纹枯病菌的拮抗试验。结果表明，当归内生真菌对小麦赤霉病菌和番茄早疫病菌的拮抗作用较为普遍，具有拮抗作用的内生真菌比例分别达到24．3%和28．6%（表1）。

表1 当归内生真菌对植物病原真菌的拮抗作用

2．2 当归内生真菌代谢物对植物病原真菌菌丝生长及孢子萌发的抑制作用

采用菌丝生长速率法考察了部分有益内生真菌代谢物对4种植物病原真菌菌丝生长的影响，结果表明，内生真菌 Coccosporell a sp．、Coniosporieae sp．1、Fusell a sp．2和Fusell a sp．3代谢物对小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻纹枯病菌生长的抑制作用最强，抑制率分别达到71．6%、62．8%、76．6%和60．7%；此外，Phacidium sp．代谢物对小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌以及番茄灰霉病菌均具有较强的抑制活性，Fusell a sp．2代谢物对番茄灰霉病菌和小麦赤霉病菌具有较强的抑制作用（表2）。

采用孢子萌发法考察了当归内生真菌代谢物对4种植物病原真菌孢子萌发的影响，结果表明，对小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻纹枯病菌孢子萌发具有抑制作用的内生真菌比例均超过20%（表3）。其中，以小黏盘孢属（Myxor mia）、暗梗梭孢霉属（Coniosporieae）以及束丝孢属（Ozoniu m）的内生真菌数量较多。My xor mia sp．2和My xor mia sp．4代谢物对4种植物病原真菌孢子萌发的抑制率均达到90%以上，Coniosporieae sp．4、Coniosporieae sp．6 以及 My xor mia sp．7代谢物对小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌孢子萌发抑制作用较强，Coniosporieae sp．7代谢物对小麦赤霉病菌和番茄早疫病菌孢子萌发的抑制活性约为其他2种植物病原菌的一倍（表4）。

表3 抑制4种植物病原真菌孢子萌发的当归内生真菌的筛选

表4 当归有益内生真菌代谢物对植物病原真菌孢子萌发的抑制作用

2．3 部分有益内生真菌发酵液活性部位的筛选

将发酵液经过低温真空浓缩至干，得到的干物质分别采用不同极性的溶剂（石油醚、乙酸乙酯、50%乙醇、水）进行提取，提取液浓缩至干，进行活性检测。结果表明，乙酸乙酯提取部位对植物病原真菌菌丝体和孢子萌发的抑制作用相对较强，表明在内生真菌的次生代谢产物中非极性、亲酯性的活性物质含量较多，但不同的提取部位对植物病原真菌菌丝生长及孢子萌发的整体抑制活性则大大减弱（表5，表6）。

表5 部分有益内生真菌发酵液不同提取部位对病原真菌菌丝生长的抑制作用

表6 部分有益内生真菌发酵液不同提取部位对病原真菌孢子萌发的抑制作用

3 讨论

在内生真菌与宿主植物构成的微生态系统中，内生真菌发挥着重要的生态学功能，对植物病原菌的抑菌、杀菌现象较为普遍［10－11］。80%的植物内生真菌在抗真菌、抗藻类或抗杂草等方面具有较强的生物活性，而来自土壤中的真菌大约只有43%具有活性［12］。其抗菌活性主要是由于能够产生多种多样的抗菌物质，一些内生真菌产生的生物碱可增强宿主植物的抗病性，抑制病原菌的生长和孢子萌发等［13］。如从卫矛科药用植物雷公藤（Tripter ygeu m wil for dii Hook F．）中分离的内生菌能产生一种新酰胺生物碱，该物质对稻瘟病菌（Pyricul aria or yzae Cav．）及其他多种植物病原真菌具有较强的抑杀作用［14－15］。从 美 丽 决 明（Cassia spectabilis）的拟茎点霉属内生真菌Phomopsis cassiae中分离到5个杜松烷倍半萜，其中3，11，12－trihydroxycadalene对球孢枝孢（Cladosporium sphaerosper mum）和枝状枝 孢 （C．cl adosporioides）的 抑 菌 活 性 最 强［16］。由此可见，在寻找新的天然药物以及植物病虫害的防治药物方面，植物内生真菌将是一个新的资源库。在本研究中，多数当归内生真菌对小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌以及水稻纹枯病菌等植物病原真菌具有较强的抑制活性，用不同极性溶剂进行内生真菌次生代谢物质的提取，结果表明内生真菌的活性物质主要存在于乙酸乙酯提取部位。此外，虽然不同提取部位的活性出现了不同程度的降低，但不同提取部位都具有一定的抗菌和抑制植物病原真菌孢子萌发的活性。本研究表明抗植物病原真菌的当归内生真菌种群具有多样性，同时其产生的活性物质也具有多样性的特点，因此药用植物内生真菌有望成为生物农药研究与开发的新资源，在植物病虫害生物防治中将具有较好的应用前景，对于中药材的栽培生产以及中药资源可持续利用等方面都具有重要的实践指导意义和理论价值。

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