适应水稻秸秆还田的抗稻纹枯病拮抗菌株的筛选

宋仅星， 于士军， 蒋 岚， 樊美珍， 朱 虹

（安徽农业大学微生物防治重点实验室，合肥 230036）

稻草是重要的有机肥源，稻草还田可减少化肥用量，降低农业成本，提高水稻品质，具有重要的生产和生态效益。将稻草机械化粉碎直接还田，是目前我国国务院、农业部和发改委大力推广的秸秆综合利用方式之一［1－2］。已有报道秸秆还田有利于减少水稻纹枯病的发生，主要原因是秸秆腐解后提高了土壤有机质的含量［3］，然而，秸秆在自然状态下腐解较慢，对后茬作物的生长不利，因此，如何促进水稻秸秆还田后快速腐解已成为亟待解决的重要问题。

水稻纹枯病是我国稻区三大病害之一，目前，主要采用化学防治控制该病，但成本高、污染环境，容易造成农药残留问题，而且长期使用容易产生抗药性。因此，利用微生物的拮抗作用来防治水稻纹枯病是近年来研究的热点。芽胞杆菌（Bacill us spp．）和木霉（Trichoder ma spp．）能产生多种抗菌物质，在植物病害生物防治中被广泛应用，它们应用于水稻纹枯病防治已有较多报道［4－9］，同时芽胞杆菌和木霉也能产生纤维素酶来分解纤维素［10－12］，对稻草秸秆有较强的降解能力。因此，本研究通过从自然界筛选对水稻秸秆有较强适应性和分解能力同时对水稻纹枯病菌又有一定拮抗作用的芽胞杆菌和木霉，然后将这些菌株返回到土壤中，对水稻秸秆还田后能快速腐解同时又能减轻水稻纹枯病的发生具有重要意义。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 样品

从水稻田里不同地点分别取土样。

1．1．2 菌株来源

水稻纹枯病菌（Rhizoctonia sol ani）本实验室保藏菌株，木霉T1、T3和T4分离自安徽省牯牛降土壤，木霉T2、T7和T9分离自安徽省天堂寨土壤，木霉T5、T6和T8分离自安徽省霍山县土壤。

1．1．3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，p H 自然。

PCS培养基：0．50% 蛋白胨，0．50%Na Cl，0．30%Ca CO3，0．10%酵母粉，p H7．0左右，1%的水稻秸秆作为唯一碳源。

稻草固体培养基：稻草粉70%，麦麸30%，含水率70%，无机盐溶液（（NH4）2SO46 g，Ca Cl20．1 g，Mg SO4·7 H2O5 g，KH2PO41 g，Na Cl 0．1 g，Fe－SO4·7 H2O 0．05 g，MnSO4·7 H2O 0．016 g，Zn－SO4·7 H2O 0．014 g）

1．2 方法

1．2．1 菌株的分离

1．2．1．1 芽胞杆菌的分离

参照张晓舟等［13］的方法。每份土样称取10 g，放入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30 min后于90℃的水浴中保持20 min。然后用无菌水进行梯度稀释后涂布PDA平板，于37℃培养箱内培养24 h左右，挑取菌落形态差异明显的单菌落进行鉴定。

1．2．1．2 芽胞杆菌的鉴定

［14－15］对菌株进行鉴定，将鉴定为芽胞杆菌的菌株进行初筛。

1．2．2 降解水稻秸秆菌株的筛选

1．2．2．1 降解水稻秸秆芽胞杆菌的筛选

参照张承胤等［16］的方法，在100 mL三角瓶内分别装80 mL PCS培养基，将初筛的芽胞杆菌做成菌悬液后，按5%的量接种到培养基中15 d后将降解剩余物经5 000 r／min离心10 min后，弃去上清液，并用8%甲酸溶液10 mL处理降解剩余物，经定性滤纸过滤，过滤时用蒸馏水分数次冲洗，将滤纸置于60℃下烘干至恒重［17］，然后测纤维素含量、半纤维素含量、木质素含量及其降解率。

1．2．2．2 降解水稻秸秆木霉的筛选

在每个250 mL的三角瓶中加入10 g稻草固体培养基，121．5℃灭菌45 min，取拮抗木霉菌株斜面各1管，在无菌操作条件下，分别将一定量的孢子刮到灭过菌的吐温80中，制备成孢悬液，然后取孢悬液于血球计数板上，置于显微镜下计数，观察计算得每毫升数量级为106个孢子。然后将孢悬液接到固体发酵培养基上，以接入无菌水为对照，重复3次，分别在第0天和第15天测量发酵体系中的纤维素、半纤维素和木质素的含量并计算它们的降解率。

1．2．3 降解菌对水稻纹枯病菌的抑制效果测定

1．2．3．1 芽胞杆菌对水稻纹枯病菌的抑制效果

1）平板对峙培养 采用PDA平板对峙生长法［18］将较好的秸秆降解菌株点接在距平板中央3 c m处的4个点上，同时平板中央移入一直径5 mm的稻纹枯病菌的琼脂块，置于25℃培养箱培养，以不接芽胞杆菌菌株作为对照，每处理4次重复。3 d后测纹枯病菌落指向芽胞杆菌的半径以及对照组的半径并计算筛选菌株对纹枯病菌的抑菌率。2）芽胞杆菌代谢物对纹枯病菌的抑制作用 将秸秆降解菌株接入LB液体培养基中，37℃振荡培养48 h，然后将发酵液高速离心，取上清液，经细菌过滤器（d＝0．2μm）过滤，得到该菌的发酵培养液，用PDA培养基把发酵液分别稀释2、10、20、40倍和100倍，然后倒平板，在平板中央接纹枯病菌菌块，25℃培养，分别于1、3 d和6 d测定菌落直径，计算对纹枯病菌的抑制率，同时观察记载菌核出现的时间，每个处理重复3次。

1．2．3．2 木霉对水稻纹枯病菌的抑制效果

1）采用PDA平板对峙生长法［18］：设只接种纹枯病菌为对照，每处理4个重复，25℃恒温培养。接种3 d后测量两接种点连线上纹枯病菌的菌落半径，以对照为基础，计算对纹枯病的抑制率，观察木霉是否覆盖纹枯病菌菌落。2）木霉代谢物对纹枯病菌的抑制作用：将木霉在25℃下培养4 d后以同等质量接种在覆盖有玻璃纸的PDA平板上，以覆盖玻璃纸但不接菌的平板作为对照，25℃下培养2 d，然后将长有木霉菌丝的玻璃纸去掉，同时去掉对照的玻璃纸，将培养2 d后的纹枯病菌以同等质量接到含有木霉代谢物以及对照的平板上，观察不同时间纹枯病菌及菌核的生长情况并计算木霉对纹枯病菌的抑制率。

1．2．4 降解菌对水稻秸秆的适应性测定

1．2．4．1 芽胞杆菌对水稻秸秆适应性测定

将芽胞杆菌做成菌悬液后，用平板计数法测定芽胞杆菌的数量，按5%的量接种到PCS培养基中，分别在3、5、7、9 d和15 d用平板计数法测定培养基中芽胞杆菌的数量，然后计算芽胞杆菌的增殖率。

1．2．4．2 木霉对水稻秸秆的适应性测定

将木霉制成孢悬液后，接到稻草固体发酵培养基上，以接入无菌水作为对照，重复3次，接种后每天观察各菌株的产孢情况。

2 结果与分析

2．1 芽胞杆菌的分离与鉴定

从水稻田分离了4株菌株，根据菌株的形态特征和培养特征对其进行初步鉴定结果见表1。

表1 4株菌的形态特征和培养特征

2．2 13株菌株对水稻秸秆的降解效果

13株菌株对稻草的腐解效果如表2所示，在发酵15 d后，水稻秸秆的不溶性碳源均有不同程度的降低，从表3可以看出4株芽胞杆菌中B4较好，15 d发酵结束后纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为1．01%、1．53%和0．41%；从表2可以看出9株木霉中T3、T5、T6和T9对水稻秸秆的降解效果较好，其中T5和T9的降解效果最好。

表2 不同菌株培养前后秸秆中不溶性碳源的含量 %

2．3 降解菌对水稻纹枯病菌的抑制效果

2．3．1 对峙培养结果

将对稻草秸秆降解较好的菌株和水稻纹枯病菌进行对峙培养，结果如表4所示，所有的菌株对纹枯病菌都有不同程度的抑制作用，B4菌株对纹枯病菌的抑菌率为40．48%，而且在对峙培养过程中，抑菌带能长久地保持，在4株木霉中，T9对稻纹枯病菌的抑制作用最强，其次是T6、T3和T5，3 d后的抑制率分别为50．99%、46．48%和45．63%，对峙培养7 d后，木霉T9、T6、T5和T3占据了整个平板，并产生了大量的绿色孢子，且与对照相比产生菌核数较少。

表3 不同处理秸秆中不溶性碳源的降解率1） %

表4 芽胞杆菌和木霉对纹枯病菌的拮抗效果1）

2．3．2 降解菌代谢物对纹枯病菌的抑制作用

芽胞杆菌B4和木霉T9、T6、T5和T3的代谢物对水稻纹枯病菌的抑制作用结果见表5和表6。表5表明，B4菌株培养液稀释2倍到稀释100倍对纹枯病菌的生长都有抑制作用，且浓度越高，抑制作用越强。稀释2倍和10倍的培养液对纹枯病菌的抑制作用最强，在第6天时抑菌率仍然保持100%，其余稀释倍数的培养液对纹枯病菌的抑制率随时间推移逐渐下降，其中纹枯病菌在含有稀释40倍和稀释100倍培养液的PDA平板上分别在第4天和第3天长满平板，但是第6天时仍然没有产生菌核，在随后的几天观察中仍然没有菌核产生，而对照组在第3天即产生菌核。从表5可以看出，这4株木霉的代谢物对水稻纹枯病菌有较好的抑制作用，第6天时对纹枯病菌的抑制率仍然为100%，而对照组中纹枯病菌在第3天长满平板并产生大量菌核，由此见得芽胞杆菌B4和这4株木霉的代谢物能抑制菌丝的生长和阻止菌核的形成。

2．4 降解菌对水稻秸秆的适应能力测定结果

5株对水稻秸秆有较强降解能力同时对水稻纹枯病菌又有抑制作用的菌株对水稻秸秆的适应能力测定结果如表7和表8所示，在15 d的发酵周期结束后，芽胞杆菌的增殖率为163．77%，可见其对水稻秸秆有一定的适应能力。4株拮抗木霉都能在稻草固体培养基上产孢，其中木霉T9产孢能力最强，说明它对稻草的适应和利用能力最强。

表5 B4菌株代谢物对纹枯病菌的抑制效果1）

表6 木霉T3、T5、T6和T9代谢物对纹枯病菌的抑制效果1）

表7 芽胞杆菌B4对水稻秸秆的适应性测定结果

表8 木霉T3、T5、T6和T9对水稻秸秆的适应性测定结果1）

3 讨论

水稻秸秆还田后在土壤中微生物的作用下快速腐解增加了土壤中有机质的含量，从而提高了水稻的抗病能力［3］，同时水稻秸秆腐解后能产生一些对植物病原菌有抑制作用的酚酸类物质［19］，因此本试验从土壤中筛选了对水稻秸秆有较好降解能力的芽胞杆菌B4和木霉T3、T5、T6和T9菌株，然后将这5株菌株配合其他腐杆剂返回到水稻田里来加速秸秆的腐解，对于秸秆腐解后的产物对水稻纹枯病菌是否有抑制作用将进一步研究。这5株菌株对水稻纹枯病菌有一定的拮抗作用，在对峙培养中，3 d时木霉T9对水稻纹枯病菌抑制率为53．38%。唐家斌［4］等报道的拮抗菌的抑制效果为52．54%，而且它们的代谢物能抑制菌丝的生长和菌核的形成，陈志谊等［8］对拮抗细菌B－916的拮抗物质进行了研究，发现具有蛋白质性质的拮抗素对纹枯病菌的抑制起主要作用。

目前筛选了利用芽胞杆菌属（Bacill us）A30［20］、木霉属（Trichoder ma）等对纹枯病菌有抑制作用的菌株，这些菌株可应用于水稻纹枯病的生物防治，王艳丽［6］等用哈茨木霉TC3和NF9进行水稻纹枯病的防治研究，发现防效可以达到62．48%～72．29%。同时也筛选了能够降解纤维素的芽胞杆菌和木霉［10－12］。然而，有关这些菌株降解秸秆、对秸秆的适应性以及它们抗水稻纹枯病菌的综合能力未见报道。本试验对筛选获得的5株具有降解水稻秸秆能力的菌株进行了对水稻纹枯病抑制效果的测定及对水稻秸秆适应能力的研究，结果表明木霉T5和T9具有降解秸秆和抑制稻纹枯病菌的双重效果。

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