剑麻抗斑马纹病鉴定技术研究

赵艳龙， 常金梅， 何衍彪， 李国平， 周文钊

（中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，湛江 524091）

剑麻（Agave sisal ana）是龙舌兰科龙舌兰属的硬质纤维作物，其纤维广泛用于制作绳缆、钢索绳心和编织剑麻地毯、工艺品等［1－2］，是国防、渔业、航海、石油、工矿等领域的重要原料。斑马纹病是我国剑麻生产中发生最普遍、危害性最大的一种真菌病害，病原菌为烟草疫霉（Phytophthor a nicotianae Breda de Haan），该菌能侵染剑麻植株地上各部分，引起叶斑、茎腐和轴腐，给剑麻生产带来严重损失［1，3］。目前生产上以“治水”（即控制麻园田间湿度）为主要防治手段，但是受品种特性、气候条件和种植结构的制约，始终无法有效地控制病情，目前普遍认为选育和应用抗病品种是唯一经济高效的防治措施［4－5］。但至今对剑麻斑马纹病的抗性鉴定还没有形成一套完善的方法，使得抗病品种的利用受到较大的限制，严重影响了剑麻抗斑马纹病育种工作的进展。本研究对剑麻斑马病纹最适宜接种条件进行摸索，同时利用活体叶片接种和离体叶片接种两种方式对生产中有抗性差异的8个种质抗病性进行评价，以期建立一套相对完善的剑麻斑马纹病的抗性鉴定方法，为剑麻抗病育种提供理论基础和实践依据。

1 材料与方法

1．1 病菌的收集及接种体准备

本试验所用菌株采自广东省东方剑麻集团农业研究所剑麻园。以常规组织分离法从剑麻斑马纹病病株上分离病原物并纯化。按柯赫氏法则验证并鉴定确认为烟草疫霉菌后，保存备用。将病菌在CA培养基（胡萝卜200 g；琼脂15 g；蒸馏水1 000 mL；p H 6．0）上25℃恒温培养5 d后，用直径为8 mm的灭菌打孔器，在距离中心3 c m处打下菌饼作为接种体。

1．2 供试剑麻种质及培育

选用生产中具有抗性差异的8个剑麻种质：‘H．11648’（Agave hybrid no．11648）、‘广西76416’（Agave hybrid 76416）、普通剑麻（A．sisalana Perr）、‘粤西114’（Agave hybrid yuexi No．114）、龙舌兰（A．americana Linn．）、‘东109’（A．potator um var．a．h‘Dongfanghong No．109’）、‘东 5’（A．potator u m var．a．h‘Dongf anghong No．5’）和灰叶剑麻（A．f ourcroydes Lemaire），其中‘H．11648’是感病品种。用盆栽法培育各种苗至存叶20片以上，选生长健壮、无病虫害的苗备用。

1．3 创伤对接种效果的影响测定

选用感病品种‘H．11648’为试验材料，按1．2中的方法育苗。从每株麻苗中下部割取完好的叶片，用70%乙醇棉球对叶片表面擦拭消毒。在消毒后叶片中部的正面分别进行创伤（针刺，下同）和未创伤处理，将打下的菌饼菌丝生长面向下分别贴在叶片中部的正面，置于保鲜盒内，用无菌棉覆盖菌饼保湿，48 h后除去棉花及菌饼，每处理10个叶片，重复3次，25℃下培养。

1．4 不同培养温度条件下接种效果的比较

选用感病品种‘H．11648’为试验材料，按1．2中的方法育苗。叶片割取、处理与接种同1．3，分别置于20、25、30、35℃和40℃下保湿培养，48 h后除去棉花及菌饼，每处理10个叶片，重复3次。

对于上述试验，接种后3、6 d和9 d分别观察病害发展情况，用直尺测量并记录病斑的大小（以病斑的纵向长度表示）。用邓肯氏新复极差法对上述各处理的数据进行统计分析。

1．5 不同接种方法对剑麻抗性评价测定

选用生产中具有抗性差异的8个剑麻种质，按1．2中的方法育苗。

1．5．1 活体叶片接种

8个剑麻种质各5株，于不同方向选取每株种苗中下部的完好叶片5片，用70%乙醇棉球对叶片表面擦拭消毒，再用灭菌后的大头针在距离叶基部10 c m处将叶片正面的表皮刺破，将菌饼的菌丝生长面向下贴在针刺的位置，用无菌棉覆盖菌饼保湿，28℃，湿度80%以上的室内条件下培养，48 h后除去棉花及菌饼，每处理重复3次。

1．5．2 离体叶片接种

8个剑麻种质各5株，于不同方向选取每株种苗中下部的完好叶片5片，将其割下，用70%乙醇棉球对叶片表面擦拭消毒。在消毒后叶片中部的正面进行创伤处理，将打下的菌饼的菌丝生长面向下贴在叶片中部的正面后，28℃下保湿培养，每处理重复3次。

1．5．3 观察、记录病情和病害分级

对于上述试验，接种后3、6 d和9 d分别观察病害发展情况，用直尺测量并记录病斑的大小（以病斑的纵向长度表示），根据9 d后测量并记录下的病斑大小，为形成抗性差异，将活体叶片接种后病害按如下标准分级：0级，叶片无病斑；1级，叶片出现病斑，但不扩展；2级，叶片出现病斑并向外扩展；3级，叶片病斑向叶基部扩展达5．0 c m以上；4级，病斑扩展到叶基部或茎部。离体叶片接种分级标准：0级，叶片无病斑；1级，0＜病斑长度≤10．0 c m；2级，10．0 c m＜病斑长度≤13．0 c m；3级，13．0c m＜病斑长度≤16．0 c m；4级，16．0 c m＜病斑长度≤19．0 c m；5级，病斑长度＞19．0 c m。

1．5．4 病情指数计算

根据记录下的数据和病害分级情况，按公式（1）计算病情指数。

式中：i—病害级别；Ni—第i级病害的病斑数；m—最高病害级别；M—调查总病斑数。

1．5．5 抗病性评价及验证

根据鉴定材料病情指数对各种质资源的抗病性进行评价，评价标准见表1。评价结果与各种质的大田抗病性进行比较，以验证该抗病性鉴定体系的正确性。

表1 剑麻斑马纹病抗病性评价标准

2 结果与分析

2．1 创伤对接种效果的影响

创伤条件对剑麻斑马纹病菌侵染叶片影响见表2。从表中可知，处理后3 d，两种处理方式已产生明显差异，接种后9 d，创伤处理后的叶片病斑长度已达到18．75 c m，是未创伤处理的7．68倍，且差异达显著水平，说明创伤对病菌的侵染与病斑的扩展起积极的作用，接种效果显著好于未创伤处理。

表2 创伤条件对接种效果的影响1）

2．2 温度对接种效果的影响

温度对剑麻斑马纹病菌侵染的影响如表3所示，在20～35℃范围内，病菌均可侵染成功，其中在25～30℃范围内侵染和扩展速度最快，接种9 d后其病斑长度在18．00 c m左右，显著高于其他温度处理，说明25～30℃是最合适的培养温度。从表3中还可以看出，当温度达到35℃时，基本不能形成侵染，接种后9 d其病斑长度仅0．41 c m，在40℃下，病菌不能侵染。

2．3 抗病性评价及其结果的验证

根据病情指数及抗性评价标准得到各种质的抗病性，并与各种质大田抗病性相比较，其结果见表4。从表4可以看出，两种接种方法，抗病性鉴定结果与大田抗性基本吻合。通过活体接种鉴定，7个种质的抗病性与实际生产全部符合，而通过离体叶片接种鉴定，7个种质的抗病性只有‘粤西114’与实际生产不符，因而相对于离体叶片接种，活体叶片接种更能准确地鉴定剑麻种质的抗病性。

表4 剑麻种质资源抗病性及与生产上抗病性比较

3 讨论与结论

本研究结果显示，剑麻斑马纹病菌最适宜的接种方法是将叶片针刺创伤后，将斑马纹病菌菌块的菌丝生长面向下贴在针刺的位置，置于25～30℃条件下保湿培养较易感病，因此建议麻农在割叶时避免雨天和湿度高的情况下操作，以便减少病害的发生。活体接种鉴定方法和离体接种鉴定方法，都可用来检测剑麻种质对斑马纹病的抗性，而活体叶片接种鉴定抗病性更加准确。

用离体叶片接种鉴定方法得到‘粤西114’的抗病性为中感，而其实际抗病性为中抗，鉴定结果与实际生产发生了偏差，可能是因为用离体叶片接种时，叶片因为离开了植物体，其抵抗病菌侵入的能力发生了变化而致。同时作者发现，用离体叶片接种与用活体叶片接种两者之间，其病情指数有时前者大，有时后者要大。但离体叶片接种后病斑的扩展速度明显较活体叶片接种后病斑的扩展速度快，这与袁庆华等报道的“离体叶接种的发病情况比田间或室内整株接种严重”一致［6］。

关于作物品种抗病性鉴定方法，传统方式一般都是将作物种植于鉴定圃，让其自然发病，通过观察各种质病害的严重程度来判定其抗病性，这种方法比较可靠，操作也比较简单，但该方法需要在具备发病的自然环境条件下才能实施，而且需要时间长［7－8］。目前关于剑麻种质对斑马纹病的抗病性鉴定不同接种方法的比较研究尚无人报道，作者尝试研究一种人为接种鉴定方法，通过活体叶片接种鉴定和离体叶片接种鉴定，均能比较准确地鉴定各种质的抗病性，且这两种鉴定方法操作简单，试验时间短。该试验仅是对剑麻种质抗病性鉴定作了初步的探索，与实际生产相比还存在一定的差异性，因此要通过不断改进，不断完善，使其能够快速而又可靠地鉴定剑麻种质的抗病性，为剑麻抗病育种及斑马纹病菌的致病力研究等提供良好的研究平台。

［1］ 李道和．剑麻栽培［M］．北京：中国农业出版社，1998．

［2］ 孙光明．剑麻栽培工［M］．北京：中国农业出版社，2007．

［3］ 赵艳龙，何衍彪，詹儒林．我国剑麻主要病虫害的发生与防治［J］．中国麻业科学，2007，29（6）：334－338．

［4］ Peregrine W T．Investigations on chemical control of zebra disease in Agave hybrid no．11648［J］．Annals of Applied Biology，2008，63（1）：45－51．

［5］ Allena D J．Control of zebra disease of Agave hybrids by breeding for resistance to Phytophthor a spp．［J］．Inter national Jour nal of Pest Management，1971，17（1）：42－46．

［6］ 袁庆华，张文淑，李敏．苜蓿褐斑病的离体叶接种研究［J］．草地学报，2001，9（1）：21－24．

［7］ 王子斌，左示敏，李刚，等．水稻抗纹枯病苗期快速鉴定技术研究［J］．植物病理学报，2009，39（2）：174－182．

［8］ 王丰，马跃，高秀岩，等．草莓品种对炭疽病抗性的鉴定技术研究［J］．果树学报，2008，25（4）：542－547．