山西枣黑顶病致病因素分析

邓彩萍， 刘贤谦＊， 刘随存， 王 琼， 李盼盼

（1．山西农业大学林学院，太谷 030801； 2．山西省林业科学研究院，太原 030012）

枣树（Ziziphus j uj uba Mill．）为鼠李科枣属植物，枣果具很高的保健及营养价值，枣产业是我国华北地区农民脱贫致富的主导产业之一，具有广阔的发展前景。

但近年来，在山西中南部枣区发现一种枣果新病害，暂称为“枣黑屁股病”或“枣黑斑病”，发病率20%～90%，使枣果失去食用与经济价值，2007年山西晋中枣区经济损失超过1亿元，对枣产业形成了较大的威胁，于是对该病病因的研究成为人们关注的焦点和热点。林忠敏等［1］认为该病属于侵染性病害；李夏鸣等［2］报道该病是由树体内源激素变化生理紊乱而发生的“枣皱胴病”。刘贤谦等［3］研究发现，该病的发病症状、发病规律、发病环境与Prakash［4］、张海岚等［5］、张承林等［6］报道的芒果黑顶病极为相似，是一种由氟污染引起的非侵染性病害，称为枣黑顶病（jujube black tip disease）。

为进一步探明该病的性质及病因，作者进行了其发病规律、病原物分离与接种、枣果枣叶及大气氟含量的测定、氟化氢诱导试验，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1．1 试验地概述

试验地位于山西省太谷地区，北纬37°30′、东经112°，属暖温带大陆性气候，四季分明，春季干旱多风，夏季炎热多雨，秋季阴湿多露，冬季少雪干冷，年平均温度9．8℃，年平均降水量465 mm，平均蒸发量1 740．5 mm，年平均湿度62%，年平均日照常数2 592．2 h，全年无霜期170 d左右。病害发病规律调查及病原物分离标样采集在榆次市东卜村、太谷县四卦、里美庄、南流、南杏林、王村壶瓶枣枣园进行；田间回接试验在山西农业大学园艺站枣园进行，枣园周围无氟污染源。

1．2 发病规律调查方法

从7月下旬开始至10月中旬结束，采用五点取样，每点取5株枣树，每枝随机调查30个枣果。每10 d调查一次，观察枣黑顶病的发病规律。

1．3 病原物分离与接种方法

病果用75%乙醇表面消毒，在0．1%升汞水浸1 min，无菌水冲洗3次，在病健交界处取病组织3～5块放入PDA培养基上，置25℃温箱培养6～8 d后，记录分离菌种的种类和数量，并及时纯化，转入试管保存。

分离到的菌种转接到PDA培养基上培养7～10 d，刮下菌丝，加无菌水制成孢子悬浮液。悬浮液中孢子浓度为10×40倍显微镜下每视野20～40个孢子［7］。

室内接种方法：采集新鲜健康枣果，用70%乙醇消毒，无菌水冲洗3次。无伤接种用直径0．5 c m的圆形纸片，蘸取孢子悬浮液贴于枣果表面；刺伤接种用灭菌的医用针头刺伤果皮造成伤口，然后用直径0．5 c m的圆形纸片，蘸取孢子悬浮液贴于伤口处。每果接种3个位点，每处理15～20个果。以无菌水作对照。接种后在28℃室温下保湿培养，每天观察并记录果实发病情况，15 d后统计发病率。

田间接种方法：在花期和幼果期喷药保护，接种前15 d停止用药。在枣果白熟期按照室内接种方法在枣果上接种，接种处覆盖灭菌湿脱脂棉，并套硫酸纸袋保湿。每处理20个果，均以无菌水作对照。9月上中旬调查接种果发病情况，记录发病果数，统计发病率。

1．4 大气及植物组织氟含量的测定

大气氟含量测定用碱性滤纸法（GB／T 15433－1995）。采集发病果园的发病果、正常果及叶片、健康果园的诱导发病果、正常果及叶片，分别称取1．00 g置于50 mL容量瓶中，加10 mL盐酸，密闭浸泡提取1 h，然后加25 mL总离子强度缓冲剂，加水至50 mL，混匀并过滤，最后采用氟离子选择电极法测定溶液氟含量［6］。

1．5 氟化物诱导方法

8月中下旬，用30、60、100、150、200、300 mg／L和400 mg／L HF溶液进行氟化物喷雾诱导试验，果面雾滴均匀，但不滴水。蒸馏水作对照，每处理重复10次，不同处理在同一棵树上随机设置，每日观察及记录处理果实的症状发生情况。

2 结果与分析

2．1 枣黑顶病发病规律

枣黑顶病在枣果膨大期、白熟期和成熟期均可发病。在枣果膨大期，病斑首先出现在果实顶部，而且大部分出现在向阳面、阳光直射的部位；在枣果白熟期和着色期，果顶出现白色晕圈，颜色逐步加深、面积加大，形成边界不太清晰的红褐色区域，红褐色区域逐步皱缩，果实其余部分仍保持正常［3］。

黑顶病发病部位调查结果（表1）显示，8月1日发病率最小，平均发病率为5．15%，之后发病率不断升高，8月10日－20日发病率增加了3．1倍，8月20日－29日发病率增加了0．5倍，枣黑顶病的发病高峰主要集中在8月。枣树不同部位黑顶病的发病率不同，树顶和外缘部分发病率较高，树中下部和内膛较低。对9月29日的调查数据进行差异显著性检验，结果显示，发病率树顶极显著地高于树下，u＝5．12＞u0．01＝2．58；外缘极显著地高于内膛，u＝5．29＞u0．01＝2．58。枣黑顶病在枣园同时大面积发病，不存在中心病株、中心病区，病株呈均匀分布。

2．2 病原物分离结果

从几个枣园内采样分离到6种真菌。8月1日的样品中仅分离到1种真菌，以后的样品中分离的菌落总数多，菌种类数也多，每次都能分离到4～5种。经初步鉴定，菌1为链格孢（Alternaria alternata）、菌2为聚生小穴壳菌（Dothiorella gregaria）、菌3未鉴定出（无分生孢子）、菌4为壳针孢属（Septoria）、菌5为毛壳属菌（Chaetomium）、菌6为镰刀属菌（Fusarium）。链格孢在每次采集的样品中都能分离到，平均分离率显著高于其他病原菌；菌2、菌3、菌4、菌5的平均分离率较高，差异不显著；菌6平均分离率较低，与其他5种菌差异显著。2008年8月1日病原菌分离率较低；8月10日以后的病原菌分离率较高，平均分离率差异不显著（表2）。

表1 枣树不同生长部位黑顶病发病率 （2008年）

表2 枣黑顶病病果病原菌分离率1）

2．3 分离菌种对枣果的致病性

对以上分离菌种的回接试验结果表明，菌种不同，回接所表现出的症状不尽相同，同一菌种在室外与室内接种产生的症状非常相近，但室外接种的发病率要低于室内；从菌种接种方式上看，刺伤接种的病果率要比无伤接种的高。毛壳属、镰刀菌属室外接种都无表现症状，室内接种毛壳属菌表现为有病斑，室内接种镰刀属菌枣果也产生病斑，湿度大时会长出白色菌丛。链格孢、聚生小穴壳菌室、内外接种试验均表现为枣缩果病症状。壳针孢属接种的病果病斑极大，几乎遍及全枣果，且发软腐烂。总之，这些从病果上分离的病原真菌回接试验，都未表现出与枣黑顶病相似的症状。

2．4 枣黑顶病发病率与枣果、枣叶、大气氟含量的相关性

不同枣园的大气氟含量，枣叶、枣果中氟含量及枣黑顶病发病率调查结果如表3所示。根据GB 9137－88《保护农作物的大气污染物最高允许浓度》中的环境空气质量要求，其氟化物（标准状态）浓度限值≤1μg／d m2·d。从表3看出，这些枣园的大气氟浓度均高于国家规定的标准浓度，最严重的东卜枣园大气氟浓度是该标准的7倍，四卦也近6倍，污染最轻的王村大气氟浓度为1．51μg／（d m2·d），接近标准浓度。枣叶、枣果氟含量及黑顶病发病率在每个枣区都不一样，氟含量和发病率的高低与大气氟化物的浓度成正相关关系。东卜枣园大气氟含量最高，枣叶、枣果中氟含量也最高，分别达到45．57、34．01 mg／kg，黑顶病的发病率也是最高，达到90．74%。王村氟污染最轻，枣叶、枣果氟含量也低，分别为9．78、9．87 mg／kg，黑顶病发病率也最低，仅为8．41%。

将各枣园的大气日均氟浓度与发病率进行相关回归分析，得一元回归方程：y＝0．120 7x＋0．810 9，γ＝0．860 6，γ＞γ0．05，4＝0．811 4，相 关 与回归关系都显著。大气氟浓度与枣黑顶病的发病率成正相关，大气中氟的浓度越高，枣黑顶病发病率也越高。

采用多元分析法，以大气氟浓度（x1）、枣叶氟含量（x2）和枣果氟含量x3为自变量，以发病率为因变量（y）进行多元相关分析，建立回归方程：y＝0．527 8＋0．037 7x1＋0．011 2x2＋0．113 3x3，复相关系数γ＝0．957 0。对方程进行F检验：F＝10．886 0，p＝0．04＜0．05，回归关系显著。

表3 枣黑顶病发病率与枣叶、枣果氟含量、大气氟含量相关性1）

2．5 氟化氢溶液诱导枣黑顶病

用400 mg／L的HF溶液对健康枣果喷雾，5 d后出现黑顶病，黑顶病症状与自然发病的症状极为相似，黑顶病枣果占到诱导果数的80%以上；300 mg／L的HF溶液也诱导出了黑顶病的症状，但症状出现较慢，喷雾10 d后出现黄色小斑块，14 d后才出现典型症状；低浓度HF溶液没有产生可见症状，果实正常生长。

3 讨论

枣黑顶病是山西省近年发现的一种枣果新病害，对枣产业已形成较大的威胁。对于枣黑顶病的病因，目前尚不清楚。部分学者认为是由病原菌引起的侵染性病害［1－2］，从病果上分离到数种病原菌，但回接均未成功，也无有效的防治方法。本研究发现枣黑顶病是一种突发性病害，短时间内在某一区域的各个枣园同时发病，不存在中心病株、中心病区，病株呈均匀分布；发病程度是外缘重于内膛，树顶重于树下。对发病组织表面消毒后放在保温保湿条件下诱发，无任何营养体和繁殖体病征发生。从发病规律、发病症状和病树、病果的分布综合比较，与芒果黑顶病非常相似，而芒果黑顶病是一种由大气氟污染引起的非侵染性病害［8－9］，因而初步推测枣黑顶病是一种非侵染性病害。

从黑顶病病果中共分离到6种真菌，室内外回接试验均未出现与黑顶病相似的症状，与前人的试验结果一致［1－2］，由此可见这6种病原真菌不是枣黑顶病的致病菌。试验中也分离到一种细菌（未鉴定），通过回接试验也未出现与枣黑顶病相似的症状。经多年调查，在黑顶病病果上并未发现细菌性病害的典型症状。对于黑顶病的诱因，Das Gupta及其同事、Ver ma和Anon都证实此病不是由寄生性微生物如细菌、真菌、病毒等引起的［4］。这也是我们未对其他病原物进行深入研究的原因。作者也用杀真菌、细菌、病毒、植原体的多种杀菌剂进行防治试验，结果均无防效；枣农用高剂量、多类型的杀菌剂、单用与复配多种方法进行防治也均无任何防效；而用防氟剂的防治效果很好，进一步说明该病不是由病原物引起的侵染性病害。

枣黑顶病的发病率与大气中的氟含量、枣叶氟含量、枣果氟含量都成正相关，而枣叶和枣果中的氟主要来自于大气，因此大气中的氟是枣果氟的主要来源。调查发现枣黑顶病发病严重的枣区附近都有砖厂，发病最重的东卜枣园附近有2座砖厂，四卦、里美庄枣园附近有9座砖厂，在吕梁黄河沿岸枣区，柳林三交镇砖厂周围枣园黑顶病严重，而远离砖厂则无黑顶病。用于生产砖瓦的黏土、砖瓦页岩及煤矸石等原料均含较高的氟，黏土中全氟含量通常为150～600 mg／kg［8］，太谷黏土全氟含量为280 mg／kg。在晒干与烘烤过程中可将其中70%以上的氟化物释放出来，排入大气。山西煤的含氟量通常为25～333 mg／kg，算术平均数为138 mg／kg，煤燃烧时可将其中78%～100%的氟化物释放出来［9］，砖厂是氟化物的重要来源。

张海岚等［5］对南海市狮山农场芒果黑顶病的调查分析表明，芒果黑顶病主要是由于大气氟污染造成的，Sen［11］在芒果园燃煤产生烟气成功地诱导出果实黑顶病。作者用氟化氢溶液也成功地诱导出枣黑顶病，进一步证实了枣黑顶病是一种非侵染性病害，大气氟污染是枣黑顶病的主要病因。

植物受到氟化物伤害后，可引起果实腐烂，降低果实品质，如桃［12］、樱桃［13］、苹果［14］受到氟伤害后，产生的症状为果顶端腐烂，与枣黑顶病的发病部位相同。除此之外，氟伤害还会引起植物叶尖和叶缘坏死，以及褪绿和过早落叶现象［15］。本研究中虽然枣叶的氟含量高于枣果，但叶片仍能正常生长，这在张承林等［6］对芒果的研究中也有相同发现，推测枣叶的抗氟害能力高于果实。Sen［11］发现不同的芒果品种对黑顶病的抗性不同，作者已开始着手对不同枣树品种的抗氟能力以及氟化物对枣树不同组织的伤害阈值进行研究。

大气中的氟化物主要是氟化氢，氟化氢的腐蚀性和渗透性很强，对植物的伤害远大于二氧化硫，推测氟化氢可能是从气孔和腐蚀孔、腐蚀斑进入果内，损伤细胞膜结构，使细胞外渗性增加，破坏了枣果的生理生化功能从而使枣果发病。有关氟化物对枣果的伤害机理有待于进一步研究。

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［3］ 刘贤谦，王琼，李盼盼．枣果新病害枣黑顶病及其诱因研究初报［J］．林业实用技术，2009（5）：33－34．

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［5］ 张海岚，吴定尧，陈厚彬．芒果黑顶病的发生及防治初步研究［J］．广东农业科学，1996（3）：34－36．

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［7］ 方中达．植病研究方法［M］．北京：中国农业出版社，1998．

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