AP-4 在恶性肿瘤中的表达和意义

苏 娜 乌日罕 孙秀威

哈尔滨医科大学附属第三医院消化内科一病区(150040)

随着人口的老龄化、人口数量的增长以及发展中国家不良生活方式的普及，全球恶性肿瘤负荷呈持续大幅上升趋势。2008年全球恶性肿瘤新发病例约为1270 万，死亡病例约为760 万，其中56%和64%出现于发展中国家［1］。恶性肿瘤是以细胞增殖和转移为特点的一大类疾病，其发生、发展与多基因、多因素的调节有关。激活蛋白4(activator protein 4，AP-4)作为转录因子AP 家族的一员，在多种恶性肿瘤中呈过表达，参与了恶性肿瘤细胞凋亡、增殖、血管生成、转移、DNA 修复等的调节。本文就AP-4 的结构、作用途径及其在恶性肿瘤中的表达和意义作一综述。

一、AP 家族简介

迄今已发现的AP 家族成员包括AP-1、-2、-3、-4、-5、-6，最早得到研究的转录因子AP-1 与细胞凋亡、增殖、分化、移行相关，并参与诱导血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达上调，从而促进肿瘤血管生成以及肿瘤的侵袭、转移，在前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中呈过表达［2～5］。AP-2 亦参与细胞分化、增殖等生理过程，并在多种恶性肿瘤中呈过表达［6］。

二、AP-4 的结构

1988年Mermod 等［7］首次报道了AP-4，其作为猴病毒40(SV40)的转录增强子结合蛋白，可在体外激活SV40 病毒的晚期转录。AP-4 具有三个二聚体化功能域，分别为一个螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)基序和两个不同的亮氨酸重复元件LR1、LR2，HLH 及其毗邻的碱性结构域对于AP-4 的序列特异性DNA 结合具有重要意义。活化的AP-4单体聚合，以同源二聚体的形式穿越核膜，识别并结合DNA上的特异性序列CAGCTG，以调控靶基因表达［8］。

三、AP-4 的作用途径

AP-4 作为转录因子，通过识别和结合DNA 上的特异性序列CAGCTG 调控靶基因表达，参与恶性肿瘤细胞凋亡、增殖、血管生成、转移、DNA 修复等的调节。

1.调节细胞凋亡和增殖

①c-myc-AP-4-p21 级联:抑癌基因p21 编码细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制因子，可由p53 以及其他多种抗增殖因子诱导表达，其表达缺失与恶性肿瘤的预后显著相关。Ogawa 等［9］以免疫组化方法检测了胃癌患者的p21 蛋白表达，发现肿瘤转移者p21 表达缺失的频率更高，p21 表达阳性者预后显著优于p21 表达阴性者。多种人类恶性肿瘤中存在原癌基因c-myc 过表达，c-myc 通过对p21 的转录抑制促进细胞周期进展，使细胞维持于增殖状态，而AP-4 参与了这一调控过程。Jung 等［10］的研究发现，在人乳腺癌细胞中，c-myc 通过AP-4 基因第一内含子的CACGTG 序列直接诱导AP-4 表达，AP-4 继而通过结合p21 启动子CAGCTG 序列直接抑制p21 表达，干扰p53 诱导的细胞凋亡;以RNA 干扰技术下调AP-4 表达后，p21 表达上调;在人角质形成细胞中，AP-4 可阻断转化生长因子-β(TGF-β)诱导的p21 表达;在原单核细胞的分化过程中，AP-4 可干扰p21 表达上调和细胞周期阻滞。该研究证实由c-myc 触发的c-myc-AP-4-p21 级联参与了细胞凋亡的调节。这一级联同样存在于结肠上皮细胞和结直肠癌细胞中。在人结肠隐窝中，AP-4 表达局限于隐窝基底部，该部位主要为未分化的增殖性干细胞和祖细胞，p21 表达缺失;而在以分化细胞为主的隐窝上部，AP-4 表达缺失，p21 表达上调。在原发性结直肠癌组织中，AP-4 呈强阳性表达，并与c-myc 表达呈正相关［10，11］。综合上述研究发现，推测AP-4 在其他恶性肿瘤中亦可通过c-myc-AP-4-p21 级联抑制肿瘤细胞凋亡，具体情况有待深入研究。

②AP-4 与caspase-9:凋亡基因caspase-9 为p53 的下游成分，参与线粒体介导的凋亡途径，通过与活化的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)结合而被线粒体释放的细胞色素C和dATP 激活，进而激活caspase-2、-3、-6、-7、-8、-10，诱导细胞凋亡。研究发现部分胃癌［12］以及对治疗耐受的慢性髓细胞样白血病［13］和头颈部鳞癌［14］中，caspase-9 mRNA 或蛋白表达下调或活性降低，推测caspase-9 表达下调可能通过抑制细胞凋亡参与了恶性肿瘤的发生、发展和耐药。然而Tsujimoto 等［15］在鉴定参与糖皮质激素诱导小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的相关基因时，发现AP-4 在正常情况下可维持caspase-9 基础水平的表达，然而一旦AP-4 表达超过某一特定水平，将不再对caspase-9 表达产生明显影响。该现象的确切机制有待进一步研究，推测可能与其他转录因子的参与有关。

③AP-4 与E7 癌蛋白:16 型人乳头状瘤病毒(HPV16)产物E7 癌蛋白可与宿主细胞的抑癌蛋白pRb 结合而使之失活，造成宿主细胞凋亡和细胞周期紊乱，打破细胞正常增殖与凋亡之间的平衡，导致细胞过度增殖，发生恶性转化。Glahder 等［16］的研究发现，E6 癌蛋白开放阅读框中的P542是E7 癌蛋白单顺反子mRNA 的转录启动子，AP-4 可与其下游序列结合而抑制其活性，从而下调E7 癌蛋白表达，减低细胞凋亡和细胞周期紊乱的可能性。推测过量的AP-4 可能系通过与内源性激活转录因子竞争结合位点而抑制P542 启动子活性。这一发现与其他研究中AP-4 呈现抗凋亡效应不同，提示AP-4 对细胞凋亡的调节作用可能是双向的，具体机制有待进一步研究。

2.调节肿瘤血管生成和肿瘤转移

①AP-4 与VEGF和MMP-9:VEGF 是一种重要的血管生成调节因子，可促进血管内皮细胞增殖、迁移、血管生成，增加血管通透性，抑制肿瘤细胞凋亡。目前研究发现VEGF 在多种恶性肿瘤中呈过表达。MMP-9 又称Ⅳ型胶原酶，可通过降解作为基底膜中其他组分构建支架的Ⅳ型胶原和其他胶原成分促进肿瘤细胞对周围组织的浸润，在肿瘤浸润、转移、血管生成中发挥重要作用。与AP-1 一样，AP-4 亦可调节VEGF和MMP-9 表达。VEGF 基因的3'-非翻译区存在AP-4 结合位点CAGCTG，推测AP-4 可能通过与该位点结合激活VEGF 基因转录，促进肿瘤血管生成。Cao 等［17］的研究显示，AP-4 蛋白表达与进展期结直肠癌的VEGF、MMP-9 mRNA 表达相关，AP-4 表达阳性的结直肠癌组织VEGF、MMP-9 mRNA 表达水平显著高于AP-4 表达阴性者。上述发现证实AP-4 在激活VEGF、MMP-9 基因转录、促进两者表达上调中起重要作用。

②AP-4 与蛋白酶激活受体4(PAR4):凝血酶受体PAR4是一类含7个跨膜区的G 蛋白偶联受体，研究显示凝血酶可通过PAR4 影响肿瘤的转移。AP-4 为PAR4 的特异性激动剂，可激活PAR4 转录。Gratio 等［18］的研究发现，以AP-4刺激人结肠癌细胞，细胞内钙离子浓度迅速升高，细胞促有丝分裂反应呈剂量依赖性增强，Src和ErbB-2 激酶参与了PAR4 异常表达促进结肠癌细胞增殖的信号转导通路。

3.参与调节DNA 损伤修复:8-oxoG(8-oxo-2'deoxyguanosine)是目前研究最多的DNA 氧化损伤，此种损伤具有致突变性，与肿瘤的发生、发展密切相关［19］。OGG1(8-oxoGDNA glycosylase)是能特异性识别8-oxoG 并将其切除的DNA修复酶，OGG1 基因突变或缺失可致细胞修复8-oxoG 的能力降低或缺失，导致恶性肿瘤的发生。Habib 等［20］发现人肾上皮细胞中AP4 与OGG1 蛋白表达呈正相关，以RNA 干扰技术下调AP-4 表达后，OGG1 蛋白表达显著减低;凝胶移位分析和染色质免疫沉淀技术证实AP-4 为OGG1 基因启动子的正向调节因子。据此推测，AP-4 表达下调时，OGG1 将不能维持正常表达水平，从而参与恶性肿瘤的发生。这一发现与既往认为AP-4 促进恶性肿瘤发生的观点不符，表明AP-4 在恶性肿瘤发生中的作用具有多样性。

4.刺激细胞增殖、分化:胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)为多种恶性肿瘤的诱导蛋白。Badinga 等［21］对人肝癌细胞IGFBP-2 基因的5'-侧翼区进行功能分析以鉴别介导该基因转录的核因子，发现其转录激活区位于-874 bp 与-765 bp之间，其中含有AP-4 结合位点CACCTG。AP-4 可与此位点结合，诱导IGFBP-2 基因转录和蛋白合成，影响肝癌细胞的增殖、分化。

四、AP-4 在恶性肿瘤中的研究

1.胃癌:研究证实AP-4 可下调p21 表达，通过c-myc-AP-4-p21 级联抑制肿瘤细胞凋亡［10，11］，而p21 表达缺失与胃癌患者预后不良相关［9］，因此推测AP-4 可能与胃癌预后有关。刘兴华等［22］以免疫组化方法和实时PCR 检测了AP-4 在胃癌和癌旁正常组织中的表达，发现其在癌旁正常组织中表达于上皮细胞的细胞核，在胃癌组织中则呈弥漫性表达，胃癌组织AP-4 蛋白阳性表达率和AP-4 mRNA 相对表达量均显著高于癌旁正常组织，其中mRNA 相对表达量高达癌旁正常组织的4.82 倍。该研究还发现AP-4 表达与胃癌浸润深度、分化程度、淋巴结转移、TNM 分期呈正相关，AP-4过表达与患者预后不良相关，AP-4 表达阳性者中位生存期显著短于AP-4 表达阴性者(12.60个月对41.40个月)。上述发现表明AP-4 基因可能作为癌基因参与了胃癌的发生、发展，AP-4 可作为预测胃癌进展和预后的分子标记物。该学者的相关研究［23］还发现，以RNA 干扰技术下调人胃癌细胞株AGS 的AP-4 表达，AGS 细胞增殖显著受抑，对化疗药物如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂、阿霉素的敏感性显著增强，这一发现为胃癌的基因靶向治疗研究提供了新的线索。

2.结直肠癌:Jung 等［10，11］发现结直肠癌中存在抑制肿瘤细胞凋亡的c-myc-AP-4-p21 级联，因此推测AP-4 可能与结直肠癌的发生、发展和预后有关。Cao 等［17］应用组织芯片免疫组化染色和实时RT-PCR 比较了AP-4 在正常结直肠组织、结直肠腺瘤和腺癌组织中的表达情况，发现其蛋白阳性表达率在三种组织中依次上调(4/32、8/32和78/160)，AP-4 表达与结直肠腺癌的肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移和预后不良相关。该作者的另一项研究［24］发现，以RNA 干扰技术下调人结肠癌细胞株SW480 的AP-4 表达能有效抑制细胞的生长、增殖和体外侵袭能力，并能诱导细胞凋亡，这一发现为以AP-4 为靶点的结直肠癌基因治疗提供了新的思路。

3.前列腺癌:L-plastin 是人肌动蛋白结合蛋白家族成员之一，其在前列腺癌中的过表达可能与肿瘤细胞的迁移、侵袭相关。L-plastin 表达的调控包括甾类激素途径和非甾类激素途径两种。林天歆等［25］对前列腺癌中L-plastin 表达的非甾类激素调控位点进行了研究，发现在L-plastin 启动子的-198～-192 之间存在一个AP-4 结合位点，吻合程度达91%，推测AP-4 可能是调控前列腺癌中L-plastin 表达的非甾类激素途径之一，参与了晚期前列腺癌对激素治疗产生耐受的发生机制。

4.乳腺癌:Buechler［26］的研究表明，在雌激素受体阳性的乳腺癌患者中，AP-4 表达阴性者无进展生存期显著长于AP-4 表达阳性者，表明AP-4 有望成为一个新的乳腺癌独立预后指标。

Amin 等［27］的研究发现，在人乳腺癌细胞株MCF-7 中，JNK MAPK 信号通路激活可抑制肿瘤细胞增殖。进一步研究JNK 激活在乳腺癌细胞中诱导抗增殖信号的分子机制，发现其可诱导转录因子AP-4和RFX-1 与上皮组织特异性SHP1 启动子结合，通过诱导SHP1 表达而抑制癌细胞增殖，SHP1 对血清或胰岛素样生长因子-1(IGF-1)刺激引起的乳腺癌细胞增殖具有明显负向调控作用。这一发现提示AP-4在乳腺癌中的作用具有多样性。

五、结语

转录因子AP-4 在恶性肿瘤中的研究已取得一些进展，目前研究结果表明AP-4 在恶性肿瘤发生、发展中所起的作用是多样性的，而并非单一促进或抑制作用，其作用机制复杂，以促进作用为主。关于AP-4 在不同恶性肿瘤中的表达情况、调控机制及其与肿瘤临床病理特征和预后的关系仍有待深入研究，反复验证。AP-4 有望成为预测多种恶性肿瘤进展和预后的分子标记物，并可能为恶性肿瘤的基因治疗开辟一条新的途径。

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