色谱-质谱联用法在体液小分子检测中的应用

王少敏 张凯 杨贯羽

(郑州大学化学与分子工程学院 河南郑州 450052)

近年来，随着联用技术的不断革新，色谱-质谱联用技术在体液小分子分析中发挥了越来越重要的作用。色谱的优势在于分离，可将复杂混合物中的各组分分离，但定性和确定物质结构的能力较差；质谱能够提供物质的结构信息，但样品需要纯化后才能进样分析。接口技术将这两种分析方法结合起来，协同作用，取长补短，使色谱-质谱联用法在生物样品分离分析中备受青睐，已广泛应用于体液小分子的检测[1]。

体液即身体内的液体，主要包括尿液、血液、唾液、羊水、人奶、精液、脑脊髓、肺腔的液体等。体液中除了水还含有丰富的化合物。体液小分子通常是指相对分子质量小于1000的物质，主要有核苷、氨基酸、糖类和其他一些代表性化合物。这些物质在体液中的种类和含量反映了机体的代谢状况，而利用色谱-质谱联用技术检测体液小分子所得到的一系列样品信息，对研究人类机体代谢有着积极的指导意义。色谱-质谱联用技术主要包括气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用和毛细管电泳-质谱联用。这些联用技术凭借各自的优势为分离分析体液小分子提供了广阔的平台。

1 气相色谱-质谱联用法(GC-MS)

GC-MS是分析仪器中最早实现联用技术的仪器。GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。样品进入气化室气化后，被载气带入色谱柱，载气的流动使样品组分在运动中进行反复多次的分配，最终载气中分配浓度大的组分先流出，固定相中分配浓度大的组分后流出。经气相色谱柱分离后的样品呈气态，并且流动相也是气体，与质谱的进样要求相匹配，可直接引入质谱，而质谱又具有高灵敏度、高鉴别力的特点，因此GC-MS是分析复杂混合物最为有效的手段之一。对于极性强、挥发性低的物质，需要衍生化后再进行GC-MS分析，在改善分析对象的挥发性同时还能提高检测灵敏度。例如梅慧芬等[2]在利用GC-MS技术对半乳糖血症患儿尿液成分的分析中检测到至少34种代谢物。

体液的种类繁多，但目前用于实验研究的主要是尿液和血液，这是由于这两种类型的体液来源广泛，采样方便并且可以连续性取样。而尿液以其非侵入性无损取样的优势，应用最为广泛。因此，我们的综述内容也主要集中于色谱-质谱技术在尿液和血液中的小分子检测。

1.1 GC-MS法检测尿液中小分子

人的尿液中包含上万种化合物，这些化合物代表了人体的代谢状况。准确分离分析尿液中的小分子化合物，能为各种疾病的诊疗提供可能的依据。例如，Nasrallah F等[3]利用GC-MS法分析了肌酸缺乏症(CDS)患者尿液中胍基乙酸和肌酸的含量，并将实验结果与HPLC-MSMS法比较，最终认定该法对于诊断CDS是一种快速、可靠、可行的方法。

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，Wu H等[4]处理了20位男性肝癌患者和20位男性正常人的尿样，经衍生化后通过GC-MS检测，发现了103种代谢产物，其中66种是已经标记过的已知物质，18种代谢产物在肝癌患者和正常人中有显著性差异——这种以尿样代谢物作为生物标志物的非侵入性技术具有重要的临床意义；朱凤英等[5]研究发现4-庚酮和二甲硫醚的含量与膀胱癌具有相关性。推测二甲硫醚可能来源于含硫化合物在人体内的合成降解，而4-庚酮可能来源于增塑剂邻苯二甲酸二异辛脂在人体内的降解；胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，目前主要依靠胃镜、病理、血清学等技术确诊，但这些手段有些敏感性不足，有些有一定创伤。张东兵等[6]比较了胃癌患者术前、术后尿液和健康人尿液的分析结果，发现患者尿液中天冬氨酸、赖氨酸、2-甲基-3-氧-丁酸乙酯含量升高，对胃癌的诊断具有潜在临床价值。

在生物遗传的研究中，8-羟基脱氧鸟苷在DNA的复制和修复过程中诱发DNA点突变，被公认为是DNA氧化损伤的一种主要的标记物。研究发现癌症患者尿液中的8-羟基脱氧鸟苷含量明显高于正常人，这在医学上有着重要的应用价值。梅素荣等[7]利用GC-MS测定了尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量，验证了GC-MS法的实用性，为癌症患者的诊疗提供了一种新的可能手段。

Kochnova E A等[8]以GC-MS技术分析了运动员尿液中的甾体化合物，共定量检测出36种内源性甾体化合物。

随着科学家对人类基因和遗传代谢研究的深入以及各种实验分析技术的发展，越来越多的遗传代谢病被检测和识别。韩连书等[9]应用串联质谱和GC-MS法检测了氨基酸代谢病、有机酸血症和脂肪酸β氧化代谢病等一系列遗传性代谢病患者的尿液，发现两种技术结合，能够同时检测出30余种遗传代谢病。

1.2 GC-MS法检测血液中小分子

人体各器官的生理和病理变化，往往会引起血液成分的改变，通过分析血液成分可以了解人体状况。例如血清葡萄糖的含量是人体健康状况的重要指标，能为糖尿病、高血压以及心脑血管等疾病的诊疗和防控提供有效依据。丁兆婷等[10]运用同位素稀释质谱法配制了一系列溶液，并向血清样品中加入内标，利用GC-MS法测定血糖含量，大大减低了测量结果的不确定度，完善了血糖含量检测的参考系统。

酒后驾车是非常严重的交通安全问题，乙醇在体内代谢很快，一般酒后几小时体内就检测不到乙醇成分，但是一部分乙醇进入体内会与尿嘧啶核苷-5′-二磷-葡萄糖醛酸结合形成乙基葡萄糖醛酸苷，如果事故时间间隔过长，血液中乙醇成分无法检测，却可以通过检测乙基葡萄糖醛酸苷的含量来解决问题。运用GC-MSMS联用方法检测血液中乙基葡萄糖醛酸苷，简单、快速，适合于检验案例[11]。

Kawana S等[12]建立了一种简单快速分析血样中氨基酸的GC-MS方法，其中包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸等，血样经过处理衍生化后，实验回收率为69.8%～87.9%，每个样品的分析时间为26分钟，这几种物质的检测限依次为24.2、16.7、8.7、1.5和12.9μmol/L。

1.3 GC-MS法检测羊水中小分子

有机酸是氨基酸、脂肪、糖类中间代谢过程中产生的羧基酸，但是由于某种酶缺陷会导致这些酸代谢异常在体内累积，因此检测体液有机酸含量可以作为疾病诊疗的一种手段。丁一峰[13]利用GC-MS分析了63例正常羊水，共检测出131种有机酸代谢物，并计算出代谢物浓度，提供了代谢物参考值，为今后遗传代谢病的羊水产前诊断提供了方法和依据；方法具有检测时间短，避免母源性污染的特点。

1.4 GC-MS法检测唾液中小分子

GC-MS法在检测唾液中化合物也有一定应用。例如Janowska E等[14]将唾液酶解、脱蛋白、固相萃取、衍生化，选取D3-吗啡和D3-可待因作为内标，利用GC-MS法检测唾液中吗啡和可待因的含量。吗啡和可待因的检测限分别是4ng/mL和5ng/mL，定量限依次为14ng/mL和15ng/mL，定量范围20～1000ng/mL，回收率为50%～60%。为了检验方法的实用性，随机抽取10位吸毒者的唾液验证，结果表明该方法适用于追踪戒毒过程。

2 液相色谱-质谱联用法(LC-MS)

ESI源的出现使LC-MS技术飞速发展。LC-MS法的基本原理是依靠分析物质在固定相和流动相中分配系数的差异，经过色谱柱将物质分离，陆续进入质谱检测。LC-MS除了能够分析GC-MS法不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物外，还具有分离能力强、定性分析可靠、检测限低等优点，因此在体液小分子的检测中具有更广泛的应用。

2.1 LC-MS法检测尿液中小分子

尿液中的修饰核苷是机体RNA的代谢产物，由于不能被机体再利用而通过尿液排出体外，因此尿液修饰核苷的含量能够反映机体细胞RNA的代谢速率以及细胞增殖状况。依托LC-MS法检测尿液中修饰核苷的研究，完善了肿瘤标志物的种类，增强了疾病检测的手段。例如，Jeng L B等[15]利用LC-MS技术对25位肝癌患者和20位健康人的尿液核苷进行了分析，结果发现肝癌患者尿液中的腺苷、胞苷和次黄苷的平均含量明显高于正常人，认为这3种核苷可以作为潜在的肿瘤标志物用于肝癌的诊断。大连化物所许国旺课题组分别以HILIC和RPLC分离法，利用UPLC-MS技术分析了肝癌患者和正常人尿液成分，结果发现HILIC比RPLC具有更高的灵敏度和稳定性[16]。此外，他们在对结肠癌研究中加入良性结肠肿瘤对照，通过UPLC-MS和SPE-HPLC对34位正常人、34位良性肿瘤(BCT)患者和50位结肠癌(CRC)患者的尿液进行了分析，结果发现苯乙酸谷氨酸有加快细胞凋亡、控制细胞增殖和调节致癌基因表达的作用，在CRC中含量最高，其含量的升高能够反映癌症的转变。在尿液核苷的检测中，2,2-二甲基鸟苷和N6-甲基腺苷在CRC和BCT中含量较高，但两者没有明显差异；而假尿苷、胞苷、尿苷和1-甲基腺苷在CRC中含量高。研究结果表明，肿瘤细胞的核苷代谢比正常人复杂，肿瘤细胞具有更高的代谢能力[17]。

单一的方法可能会使极重要的潜在生物标志物缺失，中国医学科学院/北京协和医学院再帕尔·阿不力孜课题组[18]选用不同离子源模式如(±)ESI-MS、(±)APCI-MS、(±)APPI-MS检测肺癌患者尿液。有11种物质被识别，包括5种氨基酸、5种核苷和1种吲哚代谢物，为研究肺癌代谢组学提供了有力的依据。此外，他们[19]利用RRLC-MSMS法，在数据分析中创新性地引入偏相关分析方法构建相关性网络，结合多变量分析方法共同寻找可能的生物标记物，在乳腺癌患者尿液的检测中识别出涉及氨基酸、有机酸和核苷的12种潜在肿瘤标志物。

此外，Hsu W Y等[20]利用LC-MS技术分析尿液核苷来寻求更加灵敏和精确的大肠癌标记物。Lee S H等[21]对老年痴呆症病人的尿液检测中发现3-甲基尿苷、1-甲基腺苷、8-羟基-2′-脱氧鸟苷、2-脱氧鸟苷、假尿苷和N2,N2-二甲基鸟苷等6种核苷含量比正常人显著增高。我们也利用LC-MS法在淋巴癌患者尿液提取物中鉴定出26种核苷，其中包括3-甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、5′-脱氢-2′-脱氧次黄苷、3-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟苷和7-甲基-1-乙基鸟苷6种未见报道的核苷[22]。

尿液激素类化合物的检测也是研究热点之一。在类固醇类激素的研究中，王萌烨等[23]采用LC-MSMS方法，建立起测定尿液中睾酮、表睾酮、脱氢表雄酮、雄酮和苯胆烷醇酮等5种激素的方法替代GC-MS法用于日常分析工作。

2.2 LC-MS法检测血液中小分子

系统性红斑狼疮(SLE)是一种涉及多个系统和脏器的自身免疫性疾病，我国的SLE的患病率高于西方国家。俞颖等[24]应用LC-MS技术对SLE患者血浆样本进行了代谢指纹图谱分析，定性鉴定出7种代谢标志物，发现患者的氨基酸、磷脂和卟啉代谢异常，完善了该病的诊断依据。

血液中的激素也可以利用LC-MS法检测。孕酮对妊娠妇女维持正常的妊娠过程起重要作用。张超等[25]建立了测定血液中孕酮含量的LC-APCI-MSMS联用方法：线性范围0.2～50ng/mL，最低定量限为0.2ng/mL，灵敏度高、检出限低。初阳等[26]同样利用HPLC-MSMS联用技术建立了测定人血清内源性激素睾酮含量的方法。

在对血浆氨基酸的检测中，赵华等[27]利用LC-MS技术检测了血浆中的异亮氨酸异构体，并测定了血浆中异亮氨酸异构体的含量。血浆氨基酸代谢谱与糖尿病有相关性，韩晓菲等[28]采用邻苯二甲醛柱前在线衍生反相HPLC法建立了血浆中21种氨基酸代谢谱的相对定量方法，通过比较糖尿病患者与志愿者的氨基酸代谢发现，有7种氨基酸承载了分组的重要信息，可作为反映血糖值高低变化的标志物组，对于糖尿病的早期诊断及深入研究具有潜在的科研及临床价值。

2.3 LC-MS法检测唾液中小分子

唾液中物质的检测主要应用于药物的服用检测。例如，Coulter C等[29]利用LC-MSMS分析唾液中的一种新的镇疼药tapentadol及其代谢产物N-desmethyltapentadol (DMT)，检测线性范围是10～100ng/mL，最低定量限是10ng/mL，两者回收率均大于99%。虽然LC-MS技术能够检测80%有机化合物，但其自身也有不足，还需要不断完善。

3 毛细管电泳-质谱联用法(CE-MS)

CE是近年发展迅速的一种分离分析方法，其基本原理是电泳和色谱，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。CE-MS与LC-MS的应用在方法学和分析对象上有许多相似之处。例如都适用于小分子和大分子的分析，适用于热不稳定、强极性分子乃至离子型化合物的分离分析，具有分离效率高、分析速度快、样品适应面宽、试剂盒样品消耗量少、分离模式多等特点。它的高度分离能力与质谱的强鉴定能力联用在一起，是一种理想的完美结合。例如，Johannesson N等[30]建立了用于阑尾炎病人血样中生物标记物筛选的CE-MS方法，发现病人治疗前后的血样有差异，两种不同类型的阑尾炎也有差异。Mayboroda O A等[31]利用CE-TOF-MS技术分析尿样中的氨基酸，通过调节pH可使大多数氨基酸检出限低于50nmol，并成功分析了关节炎病人尿样。浙江大学程翼宇课题组[32]利用CE-MS法分析了20位膀胱癌患者和20位正常人患者尿液，检测到m/z317、290、304可以作为潜在的生物标志物。

4 结语

人类探寻自身奥秘的过程是一部科技发展史。色谱-质谱联用法的发展推动了体液小分子检测的进程，目前的联用方法实现了对生物样品快速准确的分析，具有高通量、高灵敏度的特点。GC-MS相比LC-MS来说具有通用型检测器，并且具有丰富的谱图检索库，使得物质的定性分析快速方便准确，但由于其对样品挥发性的限制，不能直接分析难挥发的有机化合物。GC-MS直接导入型接口的载气限于氦气和氢气，当从色谱柱出口进入质谱离子源的载气流量高于2mL/min时，离子源的真空度会下降。因此，GC-MS在简化样品预处理过程，改进衍生化方法等方面仍有改进的空间。

对于LC-MS来说，仪器昂贵，使用有机溶剂作为流动相，分析成本高于GC；当采用含不挥发性盐的流动相时，质谱的灵敏度会下降，且离子源会被污染；此外，LC不能分析常规气体；LC-MS目前还没有像GC-MS那样的通用谱库。这些都影响了LC-MS作为常规方法的应用。

CE-MS技术的发展尚不完善，在分析重现性和灵敏度等方面仍需不断改进。除了不能使用不挥发性盐以外，无鞘流电喷雾接口的稳定性还较差。不断改进接口技术，CE-MS技术会在药物分析、临床医学、单细胞分析尤其是蛋白质组学等热门领域发挥更全面、更强大的作用。可以预见，随着科学技术的不断成熟，联用法在体液小分子检测乃至其他领域的应用将越来越广阔，具有巨大的发展空间。

参 考 文 献

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