与泛素-蛋白酶体代谢途径有关的放射敏感性基因

杨 波综述，谢丛华审校

（1.广州军区武汉总医院肿瘤科，湖北 武汉 430070；2.武汉大学中南医院放化疗科，湖北 武汉 430071）

泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin proteasome pathway)是细胞内ATP依赖的非溶酶体蛋白降解系统[1]，是体内重要的转录后蛋白质修饰手段。它可以高效并高度选择性地降解各种功能蛋白、癌基因产物等，还可以调节蛋白质构象、细胞内定位和多种酶活性，从而影响或调节多种细胞活动，包括基因转录、细胞周期调节、免疫反应、细胞受体功能及肿瘤生长、炎症过程等，在生物体内发挥着重要的作用。

1 泛素-蛋白酶体代谢途径

泛素(Ubiquitin，Ub)是一个由76个氨基酸组成的高度保守的小分子蛋白，最早于1970年Avram Hershko在研究酪氨酸转氨酶的ATP依赖性降解过程中被发现，当时被命名为ATP依赖性蛋白酶解因子1（ATP-dependent proteolysis factor 1，APF-1），后来发现其广泛分布于各种真核生物体细胞内而得名泛素。其分子量为8 kDa，结构上高度保守，主要在蛋白降解、膜转运、染色质构成和转录、DNA修复和信号转导起到中转作用[2-3]。泛素在多个酶的作用下，通过一系列步骤与靶蛋白结合，即通过泛素羧基末端与靶蛋白中的赖氨酸形成共价结合的蛋白分子，而连接在靶蛋白上的泛素又可以被其他泛素继续结合从而形成多聚泛素链，引起相应的生物学效应，被称为“泛素化”。泛素化过程至少需要三种酶活化参与：泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。ATP使泛素C末端的腺苷酸活化，与E1酶半胱氨酸形成硫酯键，接着与E2酶形成另外的硫酯键中间产物，最后通过E3连接酶的帮助与底物蛋白结合[4]。有趣的是，不同的多聚泛素链具有不同的生理功能，与底物蛋白结合的lys48链和lys11链（Ub48和Ub11）可以将靶蛋白与26s蛋白酶体相结合，介导蛋白质降解[5]；而lys63链（Ub63）的连接则具有信号传导功能，在DNA损伤的耐受，炎症反应，胞吞过程及核蛋白合成中发挥重要作用[6]。蛋白质泛素化是一个可逆的过程，泛素可以在去泛素化酶家族（DUB）的作用下从其目标底物上分离。

2 与泛素-蛋白酶体代谢途径有关的放射敏感性基因

2.1 p53 p53是目前研究最多的肿瘤抑制基因和促凋亡基因，人类p53基因位于染色体17p13.l，包含有11个外显子和10个内含子，长16～20 kb，相对分子质量为53 kDa，编码393个氨基酸残基。p53在正常细胞辐射后损伤修复过程中发挥了重要作用，当细胞受到放射线照射引起DNA双链或单链断裂后，ATM基因激活，细胞内p53浓度迅速上升，进而激活p21基因和bax基因的表达，使细胞停止分裂进行DNA修复，如修复失败则使细胞进入程序性死亡。根据文献报道，有超过50%的人类肿瘤存在p53基因突变。p53基因的导入可以高效的诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时，p53还与肿瘤细胞的放射敏感性密切相关。野生型p53基因可以增加肿瘤的放射治疗敏感性，p53基因表达缺失或者突变则会引起放射抗拒。Shiomitsu等[7]研究发现，上调D17骨肉瘤细胞野生型p53基因的表达，可以显著提高其放射敏感性。Bohnke等[8]研究多种肿瘤细胞株发现，表达野生型p53基因的肿瘤细胞放射敏感性明显高于表达突变型p53基因的细胞。Anwar等[9]报道，肿瘤细胞内p53水平较低与泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白降解有关。将MG132（泛素-蛋白酶体途径抑制剂）加入体外培养的恶性黑色素瘤细胞中，可以检测到p53表达上调，对照组中p53水平无明显变化。进一步研究提示MG132可以阻止p53的Ser-15和Ser-20磷酸化，延长其在体内的半寿期，提高稳定性。鼠双微粒体基因2（mdm2）是p53下游基因，同时Mdm2也作为E3连接酶使p53泛素化并且驱使p53降解,从而形成了负反馈调节。在正常生理条件下,Mdm2抑制p53的表达[10]。

2.2 Chk1在细胞周期的各个时相中存在着检测点(Check point)，它能识别细胞周期进程中出现的错误，并诱导细胞产生抑制性因子，阻止细胞周期继续运行。当DNA复制受到干扰或者DNA损伤发生时，细胞周期的检测点就被激活，使细胞有足够的时间修复DNA损伤，待细胞损伤修复后，细胞周期又恢复运转，此过程被称为细胞周期的恢复，这一过程对于细胞维持细胞周期的节律性和保障DNA复制的保真性至关重要。细胞周期存在3个检测点，即G1，S期和G2/M期检测点。冯建明等[11]报道：R16（新萘酰亚胺类化合物）可以促进Chk1被泛素-蛋白酶体途径降解，减少细胞内Chk1蛋白的水平。使用半定量反转录PCR和Realtime-PCR两种方法对HCT116细胞内Chk1的mRNA水平进行检测，结果显示，R16处理HCT116细胞24 h后，Chk1的mRNA水平未见明显变化，表明R16不是通过影响Chk1基因转录从而引起其蛋白水平的减少的。进一步采用两种特异性蛋白酶体抑制剂MG132和乳胞素分别与R16共处理HCT116细胞24 h，结果显示，两种抑制剂都能防止R16引起的Chk1蛋白减少。由于蛋白酶体依赖的降解与靶蛋白的泛素化密切相关，用MG132和R16共处理细胞后，用Chk1的抗体将细胞裂解液中的Chk1蛋白免疫沉淀，然后用泛素化抗体进行检测，发现在被蛋白酶体降解之前R16能够促进Chk1的泛素化。

2.3 Survivin Survivin是凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis protein，IAPs）家族成员，它通过与细胞周期相关的蛋白，比如着丝粒中心蛋白（INCENP）等的相互作用来促进细胞存活。Survivin还可以通过阻滞caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径来抑制细胞死亡。因为放疗、化疗等大多数抗肿瘤治疗都通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的生长，Survivin的抗凋亡作用可以引起放化疗等抗肿瘤治疗的抵抗。Chakravarti等[12]研究发现，抑制恶性胶质瘤细胞的Survivin表达可以提高其放疗敏感性。Rodel等[13]使用小干扰RNA转染放疗抗拒的SW480和HCT-15结直肠癌细胞株，24～48 h后Survivin mRNA和蛋白的表达明显减弱。在这期间给予放射线照射，细胞凋亡率会明显增加，凋亡蛋白Caspase 3/7的相对活性在SW480细胞中由1.8增加至2.2，HCT-15细胞中由1.5增加至1.7。转染Survivin小干扰RNA可以导致细胞G2/M期阻滞，在放射线照射时DNA双链断裂增加。这些结果都提示了Survivin通过作用于细胞周期和DNA修复机制来影响肿瘤细胞的放疗敏感性。在对59例结直肠癌患者的放化疗效果随访中，高Survivin表达也和患者的肿瘤复发、预后不良密切相关。梅柱中等[14]发现泛素-蛋白酶抑制剂Lactacystin和MG132可以上调HeLa S3细胞中Survivin的表达，这表明HeLa S3细胞中Survivin蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。

2.4 Notch Notch信号通路在细胞分化、增殖过程中起重要作用，同时，也参与了血管生成的过程。Notch通路可以被缺氧和细胞因子（IL-1、IL-6）激活，与Hedgehog和Wnt通路一起影响下游靶基因的表达。当Notch受体与配体结合后，Notch受体胞内段（Notch intracellular domain，NICD）被裂解，并转运入细胞核，引起下游靶基因的转录。而NICD正是通过泛素化而降解。Notch信号通路在正常乳腺发育和乳腺癌的发生过程中都起重要作用。在体外，过表达Notch4可以阻滞乳腺上皮细胞的分化，在转基因小鼠的体内高表达Notch4可以抑制乳腺细胞发育为分泌小叶，进而导致乳腺肿瘤[15]。这些都提示Notch表达的改变在乳腺癌的发展过程中起到十分重要的作用，除了Notch4以外，其他Notch受体和Notch配体也可以影响正常乳腺上皮细胞和乳腺肿瘤细胞的自我更新能力和分化，从而影响到肿瘤细胞的放射敏感性。Phillips等[16]研究了电离辐射是否直接影响Notch-1信号通路,发现分次放射线处理激活Notch-1信号通路，将会引起乳腺癌干细胞的增加，从而在分次放射治疗间隔提供了一个加速再增殖的机会,引起放射抗拒。

2.5 Cyclin D1 Cyclin D1即细胞周期蛋白D1，其基因位于人染色体11q13区位，表达产物长度为120 kb，由295个氨基酸构成[17]。Cyclin D1与细胞周期依赖性蛋白激酶（Cyclin dependent kinase，CDK）中的Cdk4和Cdk6结合，形成视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，Rb)磷酸化激酶。Rb磷酸化后，失去对E2F转录因子的抑制活性，从而活化一系列基因，导致细胞由G1期向S期转化，启动DNA复制。在恶性淋巴瘤、甲状腺肿瘤等很多人类肿瘤中都可以检测到Cyclin D1基因的重组、扩增和过表达。在人工培养的成纤维细胞中过表达Cyclin D1，也可以检测到G1期的明显缩短。将Cyclin D1反义寡核苷酸转染至体外培养的肿瘤细胞株中以抑制Cyclin D1基因表达，可以逆转肿瘤细胞的恶性增殖表型。由于Cyclin D1促进肿瘤细胞的恶性增殖，也可以导致肿瘤细胞对放疗不敏感，引起放疗后肿瘤复发。Sundberg等[18]报道，地塞米松可以通过降低神经干细胞内Cyclin D1的水平来阻滞细胞周期，但MG132可以逆转地塞米松引起的Cyclin D1水平下降，这表明地塞米松可以促进Cyclin D1经过泛素-蛋白酶体途径降解。

另外，许多细胞周期调控因子如p27[19]、p21、Cyclin A、Cyclin E等都是泛素-蛋白酶体途径底物。由于这些影响DNA损伤后修复有关的基因所编码的蛋白通过泛素-蛋白酶体途径代谢，那么基于泛素-蛋白酶体途径来研究影响肿瘤细胞放射敏感性可能是今后放射肿瘤学的研究方向之一。

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