异氟醚麻醉对老年大鼠海马微管相关蛋白tau剪切的影响

张晓光 薛张纲 仓静

（复旦大学附属中山医院麻醉科，上海 200032）

吸入麻醉药可加重阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的神经病理改变。AD的神经病理特征为神经细胞外以β淀粉样蛋白（amyloidβ，Aβ）沉积为核心形成斑块，神经细胞内以过磷酸化的微管相关蛋白tau为核心形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）和神经细胞丢失。有研究［1］显示异常剪切的tau蛋白也是NFT的成分之一［1］。异氟醚可以促进γ分泌酶的作用，增加Aβ的表达，促进Aβ寡聚化，增加Aβ的细胞毒性［2］；它还可以活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3），诱发神经细胞凋亡，使β淀粉样蛋白前体蛋白（amyloidβ precursor protein，APP）分裂酶和γ分泌酶的含量增加，并促进Aβ的表达［3］。但目前尚无报道表明异氟醚是否可以促进tau蛋白的剪切。Tau－C3是tau蛋白在D421位点被剪切后产生的片段。本研究旨在探讨异氟醚麻醉对Sprague Dawley（SD）老年大鼠海马Tau－C3含量的影响及其可能机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物处理 将16只Sprague Dawley（SD）老年大鼠（＞18个月）随机分为对照组（n＝8）和麻醉组（n＝8）。将麻醉组大鼠置于气密性良好有机玻璃麻醉箱中，进气口与麻醉机呼吸回路相连，出气口与麻醉气体监测仪连接以监测麻醉箱内异氟醚、O2及CO2的浓度。载气中O2浓度为40%，新鲜气体流量为2L／min。当气体监测仪上显示异氟醚浓度达到1.5%时开始计时，使呼气末异氟醚浓度维持在1.5%～2%，异氟醚吸入时间为6h。对照组吸入气体中不含异氟醚，其他条件与麻醉组相同。观察大鼠的呼吸频率、幅度以及皮肤粘膜颜色。监测肛温，将麻醉箱置于水浴中，使大鼠肛温维持在35.5～36.5℃。

1.2 免疫组化多重标记 用8%水合氯醛腹腔注射（300mg／kg）麻醉大鼠后，迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室灌流200mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）后继续灌注4%多聚甲醛溶液（Sigma－Aldrich）200mL；然后剥离脑组织，将其放入4%多聚甲醛，于4℃冰箱内固定48h。固定后用10%、20%和30%蔗糖溶液依次沉底后，进行冰冻切片，片厚度为15μm。自前中海马部位开始切片，5张作为1套切片，每只大鼠取1套切片留备免疫组化染色。每张切片任意选取2个视野（×400），计数 Tau－C3阳性的细胞数、c－Casp3阳性的细胞数以及Tau－C3和c－Casp3均为阳性的细胞数。

1.3 免疫印迹法 将大鼠的海马组织放入1.5mL Eppendorf管中，称质量后，放入液氮中冻存。加入裂解液后在冰上用玻璃匀浆器匀浆后置于冰上裂解1h。以14 000r／min的速度于4℃ 离心30min，收集上清液并将其分装后保存于－80℃。采用BCA蛋白定量试剂盒检测每个样品的总蛋白浓度，并补加裂解液调整使各个样品的蛋白浓度相近后，按照常规的免疫印迹法进行操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，数据以均值±标准差（¯x±s）表示。组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 麻醉组老年大鼠海马Tau－C3的含量显著高于对照组 麻醉组Tau－C3阳性细胞数为（5.6±2.4）个／高倍视野，而对照组为（2.5±1.2）个／高倍视野，2组间有显著差异（t＝3.041，P＜0.01）。麻醉组Tau－C3免疫印迹条带的相对光密度也显著高于对照组，见图1。

图1 Tau－C3免疫印迹条带及光密度统计图

2.2 Tau－C3的增加与caspase－3的激活无关 免疫组化多重标记的结果显示，95%的Tau－C3阳性细胞内并无c－Casp3，见图2。

图2 免疫组化多重标记实验结果

2.3 异氟醚麻醉不能引起老年大鼠脑内的c－Casp3增加 免疫印迹的结果显示，麻醉组和对照组老年大鼠脑内均仅检测到极少量的c－Casp3，且2组间c－Casp3的含量差异无统计学意义，见图3。

图3 c－Casp3的免疫印迹条带及光密度统计图

3 讨 论

近年来的研究［4］显示异常剪切的tau蛋白在AD的病理中也占有重要地位。异氟醚是一种临床常用的吸入麻醉药，显示异氟醚麻醉可以促进tau蛋白病的转基因动物模型—tauP301L转基因小鼠的tau蛋白磷酸化、聚集以及从微管上解离。

本研究发现异氟醚麻醉组老年大鼠海马Tau－C3的含量显著高于对照组。异氟醚促进tau蛋白磷酸化是由于异氟醚麻醉导致低体温的原因。本研究中采取保温措施，避免了低体温的干扰，大鼠在麻醉过程中亦无缺氧的表现。

Xie［3］等通过一系列研究证实异氟醚在细胞水平可以增加caspase－3表达、诱导神经细胞凋亡及增加Aβ表达。研究显示，AD转基因小鼠脑内Tau－C3含量的增加与caspase－3激活无关［5］。通过免疫组化多重标记的方法，本研究发现在绝大多数Tau－C3阳性的神经元内并无c－Casp3存在；免疫印迹的结果也提示异氟醚麻醉并不能增加老年大鼠脑内c－Casp3的含量。由此我们推测异氟醚麻醉使老年大鼠脑内tau蛋白的剪切产物的增加与caspase－3的激活无关。

［1］ Zhang Q，Zhang X，Sun A.Truncated tau at D421is associated with neurodegeneration and tangle formation in the brain of Alzheimer transgenic models［J］.Acta Neuropathol，2009，117（6）：687－697.

［2］ Eckenhoff RG，Johansson JS，Wei H，et al.Inhaled anesthetic enhancement of amyloid oligomerization and cytotoxicity［J］.Anesthesiology，2004，101（3）：703－709.

［3］ Xie Z，Dong Y，Maeda U，et al.The common inhalation anesthetic isoflurane induces apoptosis and increases amyloid beta protein levels［J］.Anesthesiology，2006，104（5）：988－994.

［4］ Delobel P，Lavenir I，Fraser G，et al.Analysis of tau phosphorylation and truncation in a mouse model of human tauopathy［J］.Am J Pathol，2008，172（1）：123－131.

［5］ Zhang Q，Zhang X，Chen J，et al.Role of caspase－3in tau truncation at D421is restricted in transgenic mouse models for tauopathies［J］.J Neurochem，2009，109（2）：476－484.