高效液相色谱-荧光检测方法用于单胺氧化酶抑制剂抑制效果的评价

王珊珊，马培翔

（1.山东省分析测试中心大型精密仪器重点实验室 山东 济南 250014；2.北京理工大学生命科学与技术学院 北京 100081）

单胺氧化酶（MAO, EC 1.4.3.4）是存在于细胞线粒体外膜上的，含有硫氢基的一种黄素蛋白[1]。其在体内的主要功能是催化内源性和外源性单胺类物质（如5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素等）的代谢[2]。在MAO的作用下，单胺类物质被氧化而产生脱氨基作用[3]：

单胺类物质在神经系统中主要以神经递质的形式存在，MAO通过氧化脱胺作用调节这些单胺类物质的含量，从而起到调节神经递质代谢的作用，因此MAO活力与抑郁症和许多神经系统退行性疾病有关，如帕金森症，老年痴呆症和抑郁症等，对其抑制剂的研究一直是治疗相关疾病的热点。

由于单胺氧化酶可以催化犬脲胺（Kynuramine）发生反应（如图1所示）[4]。生成荧光物质4-羟基喹啉（4-Hydroxyquinolin，4-HQ） ，因此可利用HPLC－荧光检测法来检测4-HQ生成量的变化，从而进一步得出MAO酶抑制剂的抑制效果。

本文在实验室条件下，利用从鼠肝中提取的单胺氧化酶，检测抑制剂的抑制效果，与液体闪烁计数等其它方法相比，方法简单安全，易于操作，稳定性好且灵敏度高。

图1 MAO催化Kynuramine的反应机理

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

甲酸铵（分析纯，北京市旭东化工厂），甲酸（色谱纯，迪马公司），Kynuramine（Sigma公司），4-Hydroxyquinolin（Sigma公司），Triton X-100（北京拜尔迪生物公司），Wistar大鼠购自军事医学科学院。

1.2 色谱条件

Agilent 1100系列四元泵和自动进样装置；Waters 474荧光检测器；色谱柱：ZORBAX ECLIPSE XDB-C18( 2.1×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇：0.1%甲酸铵水溶液(25:75, v/v)，进样量2 μL，流速0.2 mL/min，室温；激发波长：315 nm，发射波长：380 nm。

1.3 单胺氧化酶的提取纯化

1.3.1 单胺氧化酶的提取

单胺氧化酶的提取方法，参照文献[5]，并作了调整，简述如下。Wistar大鼠颈椎脱臼处死，取其肝组织，在冰浴中用250mM的蔗糖溶液洗净，然后将肝组织迅速剪碎转入10mM的Tris·HCl 缓冲液（pH 7.5，mg:V=1:10 ）（含250mM的蔗糖和10mM的EDTA）中匀浆，；匀浆液在4℃，2000g的转速下离心30min，取上清液17000g，4℃下离心20min，重新收集沉淀，用三蒸水洗涤离心沉淀三次，最后得到的沉淀就是粗提取单胺氧化酶。

1.3.2 单胺氧化酶的纯化

单胺氧化酶的纯化方法，参考文献[6]稍作修改，简述之：将收集到的粗酶沉淀悬浮于添加了Triton-X100 (0.5% v/v)的Tris/EDTA缓冲液中匀浆，4℃；将匀浆液在4℃，160000g下离心40min,收集上清液。在上清液中加入65%（m/v）的硫酸铵，混悬后在4℃，4000g下离心30min，上层析出的黄色油状物，即为纯化后的单胺氧化酶，最后用PBS溶解收集。

1.4 单胺氧化酶的鉴定

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法对提纯单胺氧化酶的分子量进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 单胺氧化酶分子量的鉴定

经测定，所提取的单胺氧化酶的分子量约为56.6KD左右（如图2所示），与文献中精确测定的MAO分子量58KD相比，具有较好的一致性，因此从凝胶分析可初步证明得到了单胺氧化酶，而且从凝胶上的条带可以看出，提纯的效果比较好，杂蛋白比较少。

图2 纯化后的单胺氧化酶凝胶电泳图

2.2 HPLC－荧光检测器检测4-HQ方法的建立

2.2.1 4-HQ标准曲线的测定

图3 A为提取得到的单胺氧化酶的色谱图，B为底物Kynuramine的色谱图，A和B作为空白对照。C图为4-羟基喹啉标准品的色谱图，D为单胺氧化酶与底物Kynuramine反应的色谱图。其中色谱条件：色谱柱ZORBAX ECLIPSE XDB-C18（ 2.1×150 mm, 5 μm，柱体积0.35mL）；流动相：甲醇：0.6%甲酸铵水溶液=25：75；进样量2 μL；流速0.2 mL/min；检测器为WATERS-474荧光检测器，EX：315nm；EM：380nm；SSC-982数据处理系统。

在1~8μmol·L-1之间均匀取点，将4-羟基喹啉（4-HQ）标准品进样得到的峰面积和浓度的关系，用最小二乘法经线性回归，得峰面积（A）与浓度（C）的关系曲线的回归方程式为：

相关系数 R2 = 0.9969。在该关系曲线上选取浓度为2 μmol·L-1，5 μmol·L-1， 8 μmol·L-1三个点进行精密度的测量，标准偏差为0.84%（n=5），经日间精密度的测定结果，三个点的标准偏差分别为4.15%，2.45%，2.35%（n=5）。

2.2.2 酶反应时间的确定

为了便于对实际样品的检测，以从Wistar大鼠肝脏中提取到的MAO为研究对象，考察了120 min内酶的反应产物4-HQ与反应时间的关系，用最小二乘法将得到的数据进行线性回归，得到120 min内产物4-HQ浓度（C）与反应时间（t）的方程为：

相关系数R2＝0.9939，由此可以看出，在120 min内反应产物的生成量是随着反应时间的延长而呈线性增加，在能满足检测需要的条件下，为了尽量缩短反应时间，选定60 min作为实验中酶反应的时间。

2.3 经典抑制剂抑制效果的测定

本实验选用治疗精神疾病的常用药物帕吉林(优降宁，pargyline) 和氯吉兰(clorgyline)作为研究对象，考察方法的可靠性。我们将一系列不同浓度的药物加入酶反应体系中，将检测到的4-HQ浓度代入关系式（3）中计算抑制百分比(C0为对照组浓度，C为反应样品浓度)：

图4 柱外酶的反应时间与产物生成量的关系

图5 Pargyline和Clogyline的浓度与抑制百分比的关系图

经过HPLC－荧光检测器检测，得到如图5所示的抑制百分比和药物浓度之间的关系。

从图5中可以看出，随着抑制剂浓度的增大，抑制百分比也逐渐增大，Pargyline的抑制效果比Clogyline更好，且趋势明显，从而证明本文所建立的方法可用于MAO抑制剂的抑制效果的研究。

3 结论

HPLC-荧光检测器检测单胺氧化酶抑制剂活性的方法与传统的液体闪烁计数方法相比，仪器较为简单，分析速度快，重现性好，对于单胺氧化酶抑制剂的进一步研究提供高效和便捷的评价工具。

[1] 裘月 等，中国药学杂志，1994，29(10): 596~599

[2] Johnston J P.Biochem Pharmacol , 1968 , 17 (7) : 1185~1197

[3] Olanow C W.Adv Neurol, 1993, 60: 666

[4] Herbert Weissbach et.al., J.Biol Chem, 1960, 235:4

[5] M.J.Schwarz et al., Biochemistry and Behavior 2003, 75:627~633

[6] Kathrin Dittmann et al, Phytochemistry.2004, 65:2885~2891