百脉根ISSR－PCR反应体系的建立与优化

富新年，师尚礼，王 赞，李 俊，闫洪唯

（1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070；2.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京100193）

百脉根（Lotus corniculatus）又名牛角花，是豆科百脉根属多年生草本植物，原产于欧亚温暖地区，目前，在世界各地广泛种植，具有优质、高产、抗逆性强、适口性好等特点，是一种优良牧草［1］。我国华南、西南、西北、华北等地均有分布，是温暖湿润地区极具潜力的牧草之一［2，3］。百脉根具有重要的经济、生态和社会效益，研究和开发百脉根属植物的种质资源具有十分重要的意义。目前，对百脉根种质资源遗传多样性的研究主要集中在形态学［4，5］、细胞学［6－8］以及基因工程方面的应用［9］，侧重于百脉根属植物ISSR（Intersimple Sequence Repeats）分子标记的研究报道较少。因此，本试验旨在研究ISSR－PCR反应中各参数变化对实验结果的影响，并对反应体系进行优化，建立适于百脉根的ISSR反应体系，为进一步研究百脉根种群遗传多样性奠定基础。

ISSR标记是基于SSR标记技术开发出来，它避免了SSR标记开发难的缺点，是Zietkiewicz等［10］在1994年创立。基于真核生物基因组中含有大量的简单重复序列，利用单一的通用引物扩增基因组DNA，进而检测2个微卫星间DNA片段的多样性。其基本原理是在微卫星序列的一端加锚1～4个随意碱基，以此进行引物设计，PCR扩增引物两端一段反向排列的SSR序列，通过琼脂糖电泳和溴化乙锭染色，根据条带的位置和有无，进行多态性分析。……