鸡毒支原体穿梭质粒的构建

胡美容，陈鸿军，于圣青，谭 磊，仇旭升，高 崧，丁 铲*

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.中国农业科学院上海兽医研究所国家家禽工程技术研究中心，上海 200241；3.国家家禽工程技术研究中心，上海 200331)

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)感染引起的慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease，CRD)是造成养鸡业严重经济损失的主要疾病之一[1-2]。确定毒力因子是研究MG的致病机制的关键[2]。然而，除了丝状支原体丝状亚种、关节炎支原体、和肺炎支原体等少数种类以外，大多数支原体目前尚未发现质粒存在[3]，大部分基于质粒的基因操作工具不适用于支原体，从而限制了MG毒力基因的研究[4]。最近，人工改造的mini-Tn4001在该支原体中得到应用[5-6]，但是转座子在基因组中插入位点具有随机性，对靶向基因缺失的筛选工作量大，并且随机插入往往使基因表达分析变得更加混淆[7]。

为了使构建的同源重组质粒在支原体内稳定存在，提高靶向基因的缺失效率，构建的载体需在支原体中可连续复制。一些可复制载体已在上述含有质粒的几种支原体中被使用，主要是基于测序的支原体染色体复制原点(oriC)进行构建，但在不含质粒支原体中这种载体的应用尚不多见[3,8-12]。由于oriC具有严格的宿主特异性，Rohini等构建了无乳支原体的穿梭质粒[13]；Lee等基于MG oriC原点构建可复制性载体，这些质粒在模拟支原体(M.imitans)和MG染色体外可以自行复制，利用同源重组使vlhA基因失活[7]，但该载体可以在支原体的oriC区域出现整合，并且难以稳定传代。

本研究基于上述研究结果，构建基于MG oriC部分活性区域的可复制型载体，并且可以在MG中稳定存在、在传代过程中整合几率低，为研究利用该载体进行毒力基因的靶向缺失研究奠定基础。……