IMD1-53对脂多糖致ALI大鼠IL-8和IL-23表达的影响

2012-05-31 07:22师婧李建强刘玲赵卉
当代医学 2012年2期
关键词:生理盐水中性肺泡

师婧 李建强 刘玲 赵卉

自2004年由Roh等[1]系统进化分析法分析基因库,从人类和其他脊椎动物基因组证实的一种新的降钙素(CT)/降钙素基因相关肽(CGRP)家族肽—中介素(IMD),国内外相继有报道证实中介素1-53对油酸致急性肺损伤和肺脏缺血再灌注损伤、心肌缺血再灌注损伤以及肾脏缺血再灌注损伤有保护作用[2-4],但中介素1-53在急性肺损伤中与具体炎性因子关系的研究尚未见报道。已有研究证实IL-8在急性肺损伤中起致炎因子的作用,IL-23由活化的抗原递呈细胞,主要是树突状细胞分泌,通过IL-23、IL-17途径介导免疫炎症反应,现研究认为IL-23参与多种自身免疫性疾病的发生和发展。本课题拟通过建立脂多糖致大鼠急性肺损伤模型,观察肺组织IL-8、IL-23表达情况,旨在探讨外源性人工合成的IMD1-53对急性肺损伤的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar 大鼠48只(山西医科大学动物实验中心提供),体重(200±20)g。

1.1.2 主要试剂 IMD1—53粉剂(美国phoenix公司)、兔抗大鼠IL-8多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、IL-23ELISA试剂盒(上海地泽生物公司)、脂多糖(美国sigma公司)、20%乌拉坦(山西医科大学生理实验室)、生理盐水。

1.2 实验动物与分组 健康雄性Wistar大鼠48只,随机分为3组,每组16只。正常对照组(C组)各腹腔注射生理盐水1ml,1h后尾静脉注射生理盐水1ml,LPS至ALI组(ALI组)各腹腔注射生理盐水1ml,1h后尾静脉注射LPS 5mg/kg(溶于1ml生理盐水中),IMD1-53干预组(D组)各腹腔注射IMD1-532nmol/kg(溶于1ml生理盐水中),1h后尾静脉注射LPS5mg/kg(溶于1ml生理盐水中)。

1.3 动物模型建立

尾静脉注射脂多糖5mg/kg制作大鼠急性肺损伤(ALI)模型。

1.4 标本采集及检测方法

ALI、D组于LPS尾静脉注射后2h、4h各处死8只大鼠,C组在生理盐水尾静脉注射后2h、4h各处死8只大鼠,收集标本。

1.4.1 ELISA法测血清IL-23水平 根据标准品制作标准曲线,再根据样品吸光度值计算出对应浓度。

1.4.2 免疫组化法测肺组织中IL-8的水平 采用免疫组织化学染色(PV)法检测大鼠肺组织IL-8的表达,应用图像分析系统进行图像分析,结果用平均光密度值(OD)表示。

1.4.3 肺组织W/D比值测定 取1g右肺中叶组织用分析天平称重为湿质量,置于70℃电热恒温干燥箱中烤48h后称重为干质量,湿质量与干质量比值即为W/D。

1.4.4 病理检查 取右肺中叶约1cm×1cm×1cm大小组织块,用10%甲醛固定,予以常规石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肺组织病理学变化。

1.5 统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行数据统计,计数资料以均数±标准差(±s)表示,多组资料进行方差分析,各时点组间多重比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中IL-23含量 与C组比较,ALI组血清IL-23含量明显增加,并随时间延长而增加,两组差异有统计学意义(P<0.05),D组经IMD1-53干预,血清IL-23含量较ALI组减少,但仍高于C组,其与其他两组比较均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 肺组织IL-8表达变化 IL-8免疫组织化学反应阳性产物呈棕黄色颗粒,主要分布在细胞质和胞膜。结果显示,ALI组高表达IL-8,主要分布在巨噬细胞、肺泡上皮细胞、小支气管上皮细胞和血管内皮细胞。对肺组织中IL-8表达进行相对定量,用平均光密度值(OD)表示,C组表达弱,ALI组表达明显增强,D组表达较ALI组弱,处理后4h组差异有统计学意义(P<0.05),2h组有差异,但不显著,可能2h时中介素还未完全发挥保护作用,ALI组与C组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 肺组织W/D C组大鼠W/D比值两时间点变化不显著,差异无统计学意义,ALI组肺组织W/D比值明显升高,各时点与C组相比差异有统计学意义(P<0.05),D组经IMD1-53干预后肺组织W/D比值较ALI组降低,但仍高于C组。见表1。

表1 各组大鼠各时点IL-23、IL-8的表达及W/D值的变化(±s,n=8)

表1 各组大鼠各时点IL-23、IL-8的表达及W/D值的变化(±s,n=8)

注:与C组相比aP<0.05 与ALI组相比bP<0.05

IL-23(ng/L) IL-8(OD值) W/D C组 处理后2h 47.17±1.29 0.220±0.019 4.32±0.24处理后4h 48.72±1.01 0.212±0.009 4.35±0.22 ALI组 处理后2h 67.46±3.36a 0.301±0.174a 5.41±0.18a处理后4h 76.47±3.65a 0.319±0.019a 5.73±0.21a D组 处理后2h 57.43±2.37ab 0.281±0.021a 4.98±0.19ab处理后4h 52.69±1.48ab 0.276±0.020ab 4.67±0.17ab

2.4 肺组织病理学变化:大体观察C组大鼠两肺成均匀的粉白色,表面光滑,无出血灶,无肿胀;光学显微镜见肺泡间隔均匀一致无增厚,可见少量炎性细胞,肺泡结构完整,肺泡腔清晰,无明显充血水肿。ALI组两肺出现程度不一的肿胀充血,重者可见散在出血点;光学显微镜可见弥漫性肺泡间隔增厚,部分肺泡萎陷,肺间质弥漫性出血,肺泡腔可见大量炎性细胞浸润及渗液。D组经IMD1-53保护,肺组织肿胀充血、肺泡腔炎性细胞浸润及渗液、肺泡间隔增厚及肺泡萎陷程度均较ALI组明显减轻。见图1~图3。

图1 正常组(HE×400)

图2 急性肺损伤组(HE×400)

图3 中介素1-53干预组(HE×400)

3 讨论

急性肺损伤 (acute lung injury,ALI)是指机体遭受严重感染、创伤、休克、酸中毒及有害气体吸入等多种因素打击后,出现弥漫性肺泡毛细血管膜损伤所致肺水肿和微肺不张等病理特征,临床表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症等。其发病机制十分复杂,目前研究认为主要有以下几点:①炎症反应和抗炎反应失衡;②肺泡-毛细血管膜通透性增加;③肺循环和支气管循环的变化;④氧化应激。

IMD1-53是含53个氨基酸的preproMD95-147活性片段,近来研究用IMD1-53灌流离体大鼠心脏具有正性肌力作用和扩张冠状动脉效应,应用IMD1-53对离体心脏缺血再灌注损伤具有显著保护作用;用IMD1-53作用于大鼠肺缺血再灌注模型,可通过上调肺组织中PPAR-γ表达[5]、抑制氧自由基生成、中性粒细胞浸润和脂质过氧化作用对肺缺血再灌注损伤具有保护作用[6];用IMD1-53干预油酸致急性肺损伤大鼠,IMD1-53可通过抑制中性粒细胞浸润、抑制脂质过氧化反应,对油酸致急性肺损伤大鼠有一定保护作用;这些实验结果表明IMD1-53也是IMD基因表达的重要活性肽段[7],其具有抗炎、抗氧化等作用,具有很强的脏器保护作用,但其在大鼠急性肺损伤模型中对具体致炎性因子的作用尚有待研究。

近年来强调炎症反应在ALI/ARDS中的重要作用,感染、创伤导致ALI等器官功能损害的发展过程可分为三个阶段:①局限性炎症反应阶段,损伤或感染导致炎症介质在组织局部释放,诱导炎症细胞向局部聚集,促进病原微生物清除和组织修复,对机体发挥保护作用;②有限全身炎症反应阶段,少量炎症介质进入循环诱发SIRS,诱导吞噬细胞和血小板向局部聚集;同时由于内源性抗炎介质释放增加导致CARS,使SIRS与CARS处于平衡状态,炎症反应仍属生理性,以增强局部防御作用;③SIRS/CARS失衡阶段,表现为两个极端,一个是大量炎症介质释放入循环,刺激炎症介质瀑布样释放,而内源性抗炎介质又不足以抵消其作用,结果导致SIRS;另一个极端是内源性抗炎介质释放过多,结果导致CARS。SIRS/CARS失衡的后果是炎症反应扩散和失控,使其由保护性作用转变为自身破坏作用,不但损伤局部组织细胞,同时也打击远隔器官,导致ALI等器官功能损害。就其本质而言,ALI是机体炎症反应失控的结果,也就是SIRS/CARS失衡的严重后果。本实验旨在通过测定促炎性细胞因子家族中的IL-23、IL-8在各组各时点的变化,探讨IMD1-53对急性肺损伤的作用及其可能机制。

IL-23是2000年发现的一个IL-12细胞因子家族的新成员,与IL-12有40%的基因序列同源,IL-23主要作为一种促炎症细胞因子而发挥作用。最近的研究发现,急性感染过程中IL-23的产生很可能与中性粒细胞募集有关,树突细胞、巨噬细胞与脂多糖和微生物接触,几小时内便可产生IL-23,随后刺激组织T细胞和NKT淋巴细胞分泌IL-17。IL-17刺激基质细胞、内皮细胞、上皮细胞和单核细胞亚群产生IL-1、IL-6、IL-8和TNF等炎性因子。IL-8由中性粒细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞和肺巨噬细胞产生,是一种碱基-肝素结合性蛋白质,具有很强的中性粒细胞趋化作用,可趋化中性粒细胞渗出到炎症部位,参与趋化、激活中性粒细胞的全部过程。IL-8尚有抑制中性粒细胞凋亡、延长中性粒细胞寿命的功能。在肺损伤中,IL-8可使肺组织中大量的中性粒细胞聚集,并与中性粒细胞表面的特异性受体结合导致白细胞发生变形反应、脱颗粒、呼吸爆发,释放蛋白水解酶和活性氧,引起炎症反应,从而引起肺损伤。

本实验结果显示,与C组相比ALI组大鼠IL-23、IL-8两炎性因子表达水平均明显升高,反应肺微血管损伤及水肿程度的指标W/D也明显上升,两组上述3个指标差异均有统计学意义。经中介素1-53干预后,与ALI组比较,IL-23、IL-8、W/D三个指标均明显下降,但仍高于C组。肺组织病理学变化显示:C组肺组织几乎无损伤,ALI组损伤最重(弥漫性肺泡间隔增厚,部分肺泡萎陷,肺间质弥漫性出血,肺泡腔可见大量炎性细胞浸润及渗液)。D组经IMD1-53保护,肺组织损伤较ALI组明显减轻。

上述结果说明,IMD1-53对急性肺损伤具有保护作用。IL-23、IL-8均参与了大鼠急性肺损伤过程,给予IMD1-53干预后可显著降低二者在肺组织表达。据此可推断IMD1-53对急性肺损伤的保护作用可能是通过抑制促炎性细胞因子如IL-23、IL-8的表达,从而抑制炎性细胞浸润,减少炎症因子的释放来实现的。外源性补充IMD1-53可能成为防止ALI的新途径,但其与炎性因子的相互作用机制复杂,其在免疫炎症反应中的作用尚有待进一步深入研究。

[1]Roh J,Chang CL,Bhalla A,et al.Intermedin is a calcitonin/calcitonin gene-related pep tide family pep tide acting through the cal-citonin recep tor-like recep tor/recep tor activity-modifying p roteinrecep tor comp lexes[J ].J Biol Chem,2004,279(8):7264-7274.

[2]于晓敏,刘新民,齐永芬.中介素1-53对油酸致大鼠急性肺损伤的保护作用[J].中华结核和呼吸杂志,2006,29(12):808-811.

[3]Yang JH,J ia YX,Pan CS,et al.Effects of intermedin(1-53)oncardiac function and ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,327(3):713-719.

[4]陈斌,石洪波,张雪军,等.Intermedin 预处理对大鼠肾缺血离体再灌注损伤的保护作用[J].临床泌尿外科杂志,2008,23(5):385-388.

[5]刘妮,李建强,杨淑娟,等.中介素1-53对肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织PPAR—γ表达的影响[J].中国现代医生,2010,48(4):3-5.

[6]杨淑娟,李建强,刘妮,等.中介素1—53对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药物与临床,2010,10(2):153-156.

[7]Yang JH,J ia YX,Pan CS,et al.Effects of intermedin (1-53)oncardiac function and I schemia/reperfusion injury in isolated rat hearts[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,327(3):713-719.

[8]高菡,李建强,张莉娟,等.EPO对大鼠肺缺血再灌注损伤时FKN及MCP-1表达的影响[J].当代医学,2011,17(3):37-38.

[9]Yue-Xia,Jia,Jing-Hui Yang.Chun-Shui Pan.Intermedin153 protects the heart against isoproterenol-inducedischemic injury in rats[J].European Journal of Pharmacology,2006,549(113):117-123.

[10]PoynerDR,Sexton PM,Marshall I,et al.International Union of Pharmacology.XXXII. The mammalian calcitonin gene-relatedpep tides,adrenomedullin,amylin,and calcitonin recep tors [J].Pharmacol Rev,2002,54(2):233-246.

[11]贾月霞,潘春水,耿彬.Intermedin1-53保护异丙基肾上腺素诱导的心肌损伤[J].中国药理学通报,2005,21(12):1454-1459.

[12]赵卉,井军虎,李建强,等.胆红素在大鼠肺脏缺血再灌注损伤中的抗凋亡作用[J].中国药物与临床,2007(9):677-679.

[13]焦桂萍,赵兵,袁志柳,等.还原型谷胱甘肽对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].Chinese Journal of Clinical Healthcare,2006,4(2):142-144.

[14]Yamashita C,Tsuji F,Oobo H,et al.Experimental studies ont he effect s of superoxide dismutase on warm is chemicreperfusion injury of the lung[J].Nippon Kyobu Geka GakkaiZasshi,1991,39(11):2002-2005.

[15]Broccard AF,Shap iro RS,Schmitz LL,et al.Influence of p rone position on the extent and distribution of lung injury in a high tidalvolume oleic acid model of acute resp iratory distress syndrome[J].CritCareMed,1997,25:16-27.

猜你喜欢
生理盐水中性肺泡
Physiological Saline
生理盐水
经支气管肺泡灌洗术确诊新型冠状病毒肺炎1例
英文的中性TA
肺泡微石症并发气胸一例报道并文献复习
钙结合蛋白S100A8、S100A9在大鼠肺泡巨噬细胞中的表达及作用
自制生理盐水
类肺炎表现的肺泡细胞癌的临床分析
高桥爱中性风格小配饰让自然相连
FREAKISH WATCH极简中性腕表设计