RNA干扰介导的FAS基因沉默抑制小鼠结肠癌细胞免疫逃逸的研究*

刘丹 汪涯雅 黄振倩

结肠癌是常见恶性肿瘤之一，晚期结肠癌预后差，Dukes C期的 5年生存率只有30%~60%，而Duckes D期的5年生存率更低至<5%，重要原因在于肿瘤生长早期即可通过局部浸润、侵袭淋巴管或毛细血管等方式向远处播散转移，肿瘤的免疫逃逸造成机体免疫系统无法正确识别、清除播散的肿瘤细胞，癌细胞聚集生长并诱导毛细血管增生，最终在肝脏、肺、前列腺及骨等脏器发展形成转移灶。研究证明机体内存在着完善的抗肿瘤免疫监视系统和抗肿瘤免疫应答。与此同时，肿瘤细胞也进化出了一系列机制逃避宿主的免疫监视和攻击，如共刺激分子表达缺陷，分泌可溶性免疫抑制物质等，这就是肿瘤细胞的免疫逃逸。FAS（APO-1/CD95）与FASL（Fasligand）属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族，为细胞凋亡相关基因，其相互作用可诱导细胞凋亡（Apoptosis），从而维持机体发育和自身稳定所必需的细胞生理性死亡。该系统同时也是机体抗肿瘤免疫的重要组成部分。FAS抗原高表达于机体正常细胞表面，常见肿瘤如消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌，均表现为低表达FAS抗原，而高表达FASL抗原。Greeneltch等[1]和Wajant等[2]研究证实肿瘤细胞借助过表达的FasL，通过Fas/FasL途径诱导抗肿瘤活性淋巴细胞凋亡，抑制肿瘤细胞周围的肿瘤特异性效应T细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），从而逃避机体的免疫识别和免疫攻击。

本研究构建RNA干扰分子载体转染Balb/c小鼠淋巴细胞，降低肿瘤特异性淋巴细胞Fas抗原的表达。采用同种异体淋巴细胞混合培养，观察不同实验组中淋巴细胞对结肠癌细胞的诱导凋亡作用的耐受状况，探讨通过阻断FAS表达，抑制结肠癌细胞通过Fas/FasL途径诱导的抗肿瘤淋巴细胞凋亡作用及其在抗肿瘤免疫中的意义。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 Bab/c小鼠脾淋巴细胞株及小鼠结肠癌细胞株（CT26）由暨南大学李伟教授惠赠。细胞株置于含10%BSA，100 u/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的RMPI1640培养液中，于5% CO2，37 ℃环境下培养。

1.2 分子载体构建 根 据NCBI GenBank中小鼠Fas基因cDNA序列（序列号：NM_007987，按照siRNA序列设计原则，利用Ambion公司设计软件，选择2个靶位点设 计两对共四条60bp左右大小的DNA片段，靶位点为716bp-736bp和782bp-802bp，序列如下：第一对正链：5’-GATCCATAC ATCCCGAGAATTGCTTTCAAGAGAAGCAATTCTCGGGATGTAT TTTTTTGGAAA-3’；负链：5’-AGCTTTTCCAAAAAAATACAT CCCGAGAATTGCTTCTCTTGAAAGCAATTCTCGGGATGTATG-3’。第二对正链：5’-GATCCGCATCAAGGAGGGCAAGATATT CAAGAGATATCTTGCCCTCCTTGATGTTTTTTGGAAA-3’；负链：5’-AGCTTTTCCAAAAAACATCAAGGAGGGCAAGATAT CTCTTGAATATCTTGCCCTCCTTGATGCG-3’。由上海恒新公司合成引物并克隆至表达载体pSilencer3.0中，即构建成Fas基因dsRNA分子表达系统。构建完毕后转化受体菌，筛选鉴定挑选表达效率较高组作为研究工具。

1.3 细胞转染 制备的分子载体采用脂质体法转染小鼠淋巴细胞。转染48 h后，在培养状态下，用倒置荧光显微镜观察细胞生长状态及形态学改变。在镜下观察真核表达质粒中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在细胞内的表达情况并计算转染效率。

1.4 实验分组 取对数生长期的小鼠淋巴细胞105置于培养板中，根据研究需要将其分为3个组：（1）实验组：转染研究用质粒。……