皱边石杉内生真菌ISSR-PCR反应条件的优化

史云峰，禹利君，刘仲华，黄璜，胥锦桦，朱楠楠

(1.湖南农业大学 a.东方科技学院；b.农学院，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3. 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128)

石杉科植物含有治疗早老性痴呆症的特效药物成分石杉碱甲。若能从其内生真菌中获得可产石杉碱甲的菌株，有望解决早老性痴呆病人的用药需求。对石杉科植物内生真菌的研究起步较晚，主要集中在对其菌种的分离、纯化和形态学初步鉴定[1–3]，对其内生真菌进行相关分子标记的研究尚少。内部简单重复序列(inter simple sequence repeat, ISSR)结合了随机引物扩增多态 DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)和简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)标记技术的优点，无需知道基因组序列信息，DNA用量少，稳定性好，多态性高，已广泛应用于分子标记辅助育种[4–5]、植物病原菌进化与亲缘关系分析[6]、遗传多样性分析、遗传作图、基因定位等[7–9]。ISSR反应易受Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物及退火温度的影响，不同物种的试验参数均有差异。以皱边石杉(Huperzia crispata)内生真菌的 DNA 为材料，对其ISSR–PCR反应体系进行单因素试验及正交试验优化，旨在建立稳定、可靠的 ISSR–PCR反应体系，为后期从分子水平对皱边石杉内生真菌进行分类鉴定、种群遗传结构分析及种质资源的优选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

新鲜皱边石杉样品采自湖南湘西自治州永顺县小溪原始次生林国家自然保护区，从中分离纯化的 99株内生真菌保存于湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心。

Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司。……