siRNA干扰CXCR4基因对T24细胞侵袭力的影响

郑湘予，庞 霞，李晟磊，朱志强

1)郑州大学第一附属医院病理科郑州450052 2)郑州大学第一附属医院急诊科郑州450052

CXCR4是G蛋白耦联的7次跨膜蛋白受体，其与特异性配体趋化因子基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)构成的生物学轴激活的特殊信号传导途径，对癌细胞转移至好发部位种植、存活和增殖起关键作用［1］。作者采用RNA干扰技术下调人膀胱移行细胞癌T24细胞的内源性CXCR4表达水平，用Boyden小室体外细胞侵袭模型检测转染siRNA(small interference RNA，siRNA)后细胞体外侵袭能力的变化，以期寻找膀胱癌浸润、转移机制中的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 人膀胱移行细胞癌T24细胞株由上海细胞研究所提供。PCR扩增试剂盒购自北京奥科生物技术有限公司，兔抗人CXCR4单克隆抗体购自R＆D Systems公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司，siRNA和LipofectamineTM2000均购自广州锐博公司，基底膜基质胶Matrigel matrix购自美国BD公司。Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂。

1.2 CXCR4 siRNA设计、合成及纯化 根据人CXCR4基因序列(NM003467)设计如下序列:CXCR4siRNA:正 义 链 5’-UAAAAUCUUCCUGC CCACC-3’， 反 义 链 3’-AUUUUAGAAG GACGGGUGG-5’;无关序列 dsRNA:正义链 5’-UU CUCCGAACGUGUCACGU-3’，反义链 5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAA-3’。以上siRNA序列均由广州锐博公司合成、纯化。为了避免可能偏靶，采用了严格的BALST进行比对，在GenBank中证实CXCR4 siRNA仅与CXCR4基因存在相应的匹配位点，无关序列dsRNA与任何已知哺乳动物基因无匹配。

1.3 细胞培养和转染 人膀胱移行细胞癌T24细胞株采用无抗生素、含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、体积分数为5%CO2的条件下培养。调整细胞浓度，接种至6孔板，每孔约1×106个细胞。待细胞生长至80% ～90%融合时，采用脂质体LipofectamineTM2000转染，转染步骤严格按照说明书进行。……