分子伴侣GRP94在创伤后应激障碍大鼠前额内侧皮质表达变化及其意义

赵冬梅 韩 芳 石玉秀

（中国医科大学基础医学院病理研究所，组织学与胚胎学教研室；沈阳 110001）

创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder，PTSD）是以反复的创伤性体验重现，记忆异常，情绪障碍，警觉性高并伴有持续性回避症状为特征的临床综合征，患者往往有各种灾难性突发事件的经历，如海啸、地震、洪水、战争等。近几年由于突发自然灾害的频发，PTSD发病率呈逐年上升趋势。有调查资料显示［1］汶川地震过后，2250名青少年中患有PTSD症状者达15.8%之多。PTSD患者往往会出现记忆的障碍，精神障碍或焦虑综合征，或者是患者反复的回忆起恐怖的场景，由此导致身心异常痛苦，但目前尚缺乏有效的治疗手段，因此揭示其发病机制至关重要。分子伴侣葡萄糖调节蛋白94（glucose－regulated protein 94，GRP 94）是一种高度保守的内质网驻留蛋白，在正常细胞中GRP94具有协助新合成蛋白，促进内质网中未折叠蛋白正确折叠、修饰、抑制错误折叠蛋白分泌的作用。细胞内质网Ca2＋超载，缺氧等条件下都可发生非折叠蛋白反应（unfolded protein reaction，UPR），是内质网应激的反应。关于PTSD是否出现UPR，其发生过程中的作用机制及意义的研究目前未见报道，为探讨GRP94及非折叠蛋白反应在PTSD发病中的作用机制，本实验拟利用PTSD－SPS模型，采用免疫组化、蛋白免疫印迹和RT－PCR方法，检测PTSD大鼠mPFC神经元GRP94表达变化。旨在探讨PTSD有否激活UPR，为进一步揭示PTSD的发病机制寻找新药靶点提供实验依据。

材料和方法

1.实验动物和试剂

60只健康成年 Wistar大鼠，雄性，体重250－300g，由中国医科大学动物实验中心提供，GRP 94一抗购于Santa Cruz公司。引物自行设计，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

2.动物分组及造模

60只大鼠随机分为正常对照组、连续单一刺激SPS实验组（SPS－1d，SPS－4d，SPS－4d，SPS－7d）各15只，造模方法采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的方法［2－3］，将大鼠禁锢2h，立即强迫游泳20min［水深40cm，水温（24±1）℃］，恢复15min，乙谜麻醉至大鼠意识丧失，分笼常规饲养。正常对照组不做任何处理。SPS造模后1d，4d，7d各时间点取材，供分别进行的免疫组织化学、蛋白印迹、逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）使用。

3.GRP94的免疫组织化学检测

相应时间点取材，标本经5%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。采用SAB法，操作按SAB试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水，3﹪和H2O2去除内源性过氧化物酶，置入0.01 mol/L（pH 6.0）柠檬酸盐缓冲液中高压抗原修复，室温下冷却15－20min，5%BSA封闭，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次。一抗GRP94以1∶500 4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，滴加50μl生物素标记的二抗37℃孵育30min，PBS冲洗3次，滴加50μl新鲜配制的DAB溶液，显色10min；苏木精复染；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

4.Western Blot检测GRP94的表达

取新鲜标本100mg，加入0.5ml RIPA裂解液，超声粉碎仪粉碎2s5次，4℃，12000rp离心，提取上清，运用Bradford法测定蛋白浓度，5﹪浓缩胶和10﹪分离胶电泳，每孔上样量含蛋白30μg。电泳完毕后恒压45v转膜，5%脱脂奶粉37℃ 摇床封闭2h，加入兔抗鼠GRP94多克隆抗体（1∶500稀释）4℃ 过夜。TBST洗膜5min×5次，加入 HRP标记的羊抗兔IgG二抗（1：5000稀释）37℃ 摇床反应2h，TBST洗膜洗膜5min×5次，加入ECL发光显影。灰度值分析。

5.RT－PCR检测GRP94mRNA表达

造模后，于各相应时间点取材100mg，加入1mlTrizol，颠倒混匀静置5min；加0.2ml氯仿，颠倒混匀，静置5min，12000rmp离心15min，0.5ml异丙醇－20℃中1h，提出 RNA，溶于焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的双蒸水中。测得样品总RNA浓度，－80℃保存。按试剂盒说明书进行逆转录和PCR扩增，引物由上海生工生物工程技术公司合成，内参和引物序列见（表1）。GRP94扩增条件均为：94℃2min；94℃30s；52℃60s；72℃2s；30个循环，72℃8min。扩增结束后取5μl扩增产物进行l.5%琼脂糖凝胶电泳，天能GIs凝胶成像系统进行观察拍照并进行平均光密度分析，以目的条带与内参照β－actin的平均吸光度的比值表示相对表达水平，进行半定量分析。

表1 GRP94和内参引物序列Table1 primers for GRP94，β－actin

6.图像分析及统计学分析

每组随机抽取光免疫组织化学染色切片8张，每张5个视野，利用Image－Pro Plus 6.0图像分析系统，测反应强度的平均光密度值。将所得析数据结果均应用SPSS13.0软件包处理，进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.免疫组织化学检测mPFC部位GRP94的表达

GRP94免疫组化反应产物为棕黄色颗粒，定位于胞浆，可见皮质大锥体细胞胞浆内充满棕黄色的阳性反应颗粒。正常组可见少量阳性细胞，SPS造模后阳性细胞逐渐增多，至7d组表达达到最高（图1）。Image－pro plus6.0软件平均光密度分析，分析结果见（表2）。

图1 mPFC部位各组GRP94免疫组织化学表达A：正常对照组；B：SPS－1d；C：SPS－4d；D：SPS－7dall×400Fig.1 Immunohistochemistry of GRP94in mPFC of PTSD ratsA：control group；B：SPS－1d；C：SPS－4d；D：SPS－7dall×400

2.westem blotting分析mPFC部位的GRP94

蛋白印迹法检测mPFC部位的GRP94的表达，以 GAPDH（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase）的吸光度值作为内参照，对各组条带的吸光度值进行校正和半定量分析。与正常对照组相比，SPS模型组mPFC部位的GRP94蛋白水平变化明显：SPS刺激后1d后表达开始逐渐增加，至7d表达最高 （图2），分析结果见（表2）。

图2 mPFC部位各组GRP94表达（westem blotting），由左至右依次为正常对照组及SPS－1d、SPS－4d、SPS－7dFig.2 The GRP94mPFC expression in each group（westem blotting），From left to right，control group，SPS－ld，SPS－4d，SPS－7d

3.RT－PCR分析mPFC部位的GRP94mRNA表达

RT－PCR结果 （图3）显示，在正常组大鼠mPFC部位GRP94mRNA有少量表达，SPS刺激后，GRP94mRNA的表达出现逐渐上调的趋势 （P＜0.05），至7d最高，与westem blotting结果随时间变化一致。分析结果见（表2）。

图3 mPFC部位各组GRP94mRNA表达，由左至右依次为正常对照组及SPS－1d、SPS－4d、SPS－7dFig.3 The GRP94mRNA expression in each group.From left to right，control group，SPS－ld，SPS－4d，SPS－7d

表2 mPFC部位GRP94免疫组织化学平均光密度（OD），westem blotting，RT－PCR平均灰度值（±s）Table2 GRP94in mPFC mean density，average gray value（westem blotting，RT－PCR）（±s）

表2 mPFC部位GRP94免疫组织化学平均光密度（OD），westem blotting，RT－PCR平均灰度值（±s）Table2 GRP94in mPFC mean density，average gray value（westem blotting，RT－PCR）（±s）

＊与对照组比较，P＜0.05；＊＊与对照组比较，P＜0.01（＊compared with control group），P＜0.05；（＊＊compared with control group），P＜0.01

Mean density（OD）Immunohistochemistry Average gray value Westem blotting RT–PCR Control group 0.3160±0.0398 0.9110±0.0228 0.9137±0.0303 SPS－ld 0.3554±0.0327＊ 0.9685±0.0495＊ 1.40580.0400±＊SPS－4d 0.4040±0.0825＊ 0.9953±0.0520＊ 1.507±0.090＊SPS－7d 0.4772±0.0983＊＊ 1.0673±0.0333＊＊ 1.5770±0.0680＊＊

讨 论

创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder）是指经受了突发性的巨大灾难或异乎寻常威胁后产生的长期持续性的精神障碍或焦虑综合征。PTSD患者可引起明显的社会心理功能障碍，对家庭、社会和身心健康造成长期的影响。现有的研究证明PTSD患者有海马、杏仁核、蓝斑以及额叶皮质等的影像学及形态学异常改变［4－5］。mPFC是大脑功能的执行中枢，与大脑其他部位联系密切，参与情绪中枢环路的组成，是情绪中枢通路的重要环节之一。mPFC的外伤性损伤可导致患者出现情绪和社会性行为异常［6］，出现无法消退的恐惧性条件反射，而这些可能都和患者的闯入性记忆有关［7］。有研究表明［8－9］PTSD大鼠 mPFC糖皮质激素受体和盐皮质激素受体在下丘脑一垂体一肾上腺轴（HPA）的调节中有时间性的改变，提示mPFC也是HPA轴负反馈抑制部位，和海马、杏仁核、蓝斑等同是PTSD患者发病机制及临床表现中起到重要作用的关键脑区。

内质网驻留蛋白－分子伴侣葡萄糖调节蛋白（glucose－regulated protein，GRP）GRP78和 GRP94是分布在内质网腔的应激蛋白，出现在不同时期发育中的小鼠脑组织中［10］，具有促进内质网中未折叠蛋白正确折叠、修饰、保护内质网功能的作用。正常情况下GRP94即少量表达，其分布和表达均受细胞周期的调控。本实验中正常对照组免疫组化切片可见少量GRP94阳性细胞，western－blotting实验也提示正常组GRP94蛋白弱表达。真核细胞的内质网（endoplasmic reticulum，ER）负责分泌性蛋白的折叠和组装，其对内外环境的变化极为敏感，当细胞受到各种内外源刺激时，ER中未经折叠或错误折叠的蛋白增多，引起内质网应激，应急信号经内质网传递至细胞核，引起以GRP94在内的一系列特定的分子伴侣（Chaperon）的基因转录上调，与未折叠或错误折叠的蛋白分子结合使之正确折叠，细胞发生未折叠蛋白反应（unfoldedprotein response，UPR）。UPR启动以后将非折叠蛋白和错误折叠蛋白，通过内质网膜传入胞浆降解，以减少在内质网沉积和聚集。

PTSD－SPS刺激作为一种应激源可引发内质网应激，GRP 94位于内质网上，参与内质网应激。我们的前期研究阐明PTSD－SPS模型大鼠钙平衡紊乱［11］，加重内质网应激。通过内质网未折叠蛋白反应可使GRP 94大量表达，并与内质网中错误折叠和未折叠蛋白结合，恢复蛋白质的正确构象，使蛋白质能够在细胞应激状态下继续正确合成，维持内环境的稳定。SPS刺激造模后，模型组大鼠GRP94蛋白表达增高同时伴有GRP94mRNA表达逐渐增高，至第7天大鼠的mPFC部位GRP94mRNA表达和蛋白表达均到最强，无论从分子水平或蛋白水平变化趋势相符，提示了GRP94的表达调控是发生逆转录水平。

GRP94还具有维持细胞内钙平衡的作用，可能起到对细胞一定程度的保护作用。若长期过强的应激或是长时间的过度的UPR，超出GRP94处理能力，过多的非折叠蛋白沉积，使内质网自稳功能障碍，细胞将启动由内质网径路凋亡机制：激活内质网凋亡因子。随着内质网应激时间延长，细胞内稳态无法恢复，最终未折叠蛋白反应信号诱导细胞以凋亡形式死亡，保护机体组织免于应激带来的损伤［12－13］。也有学者认为：内质网内未折叠蛋白积聚时，GRP94可从正常状态下与跨膜蛋白IRE1、ATF6和PERK的结合状态分离，而应付未折叠蛋白，并启动三条通路，从而介导不同的下游反应，即存在一个负反馈机制调控GRP94的自身表达，而GRP94的活性增加又可对错误折叠的蛋白质起到降低和消除的作用［14］。

本实验结果表明SPS刺激后，大鼠mPFC神经元分子伴侣GRP94表达发生变化，提示PTSD－SPS刺激可引发内质网应激，激活mPFC神经元出现未折叠蛋白反应，PTSD的发生过程中，GRP94参与了未折叠蛋白反应，本研究对揭示PTSD的发病机制提供了实验依据，也可从GRP94对细胞的保护作用来为临床床寻找新药靶点提供新思路。

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