表达大鼠FoxA1的慢病毒制备和鉴定＊

谭拥军，谢 骊，杨 潮，何斯佳，谭桂湘

（湖南大学 生物学院，湖南 长沙 410082）

Forkhead－box A1 （FoxA1）基因原被称为hepatocyte nuclear factor 3α（HNF3α），是forkhead box转录因子家族中的一员，该家族所有成员因含有叉头状或螺旋翼状的DNA结合域而得名[1］.在乳腺癌细胞中，FoxA1作为基因转录调节的先驱因子[2－3］，结合到染色质上特定的FoxA1结合位点，通过它的染色质重建活性，促使该染色质区域开放，利于邻近DNA上的雌激素受体反应元件（EREs）结合雌激素受体[4］.在研究FoxA1作为先驱因子参与调节肿瘤增殖的功能时，需要建立FoxA1稳定表达体系.大鼠FoxA1蛋白与人FoxA1蛋白同源性高达97%，实验中大鼠FoxA1可完全行使人FoxA1的功能，因此本研究构建了感染效率高、可长期稳定表达大鼠FoxA1的慢病毒载体表达体系，为今后对FoxA1的功能研究奠定了材料基础.

1 材料与方法

1.1 材 料

大肠杆菌DH5α购自北京鼎国生物公司，表达质粒和293T细胞为本实验室保存.

慢病毒制备辅助质粒包括包装质粒△8.91、包膜质粒pVSV－G，慢病毒表达载体（plv载体是以HIV病毒为基础构建改造的慢病毒表达载体，大小约为9kb，其外源基因表达单元由EF1A启动子、外源基因多克隆位点、IRES序列和EGFP荧光标记基因组成，外源基因与EGFP之间存在IRES序列，保证外源基因与EGFP单独表达）.

乳腺癌细胞株ZR－75－30为FoxA1阴性细胞株（ATCC购买）

1.2 方 法

1.2.1 重组慢病毒质粒载体 plv－rFoxA1－IRESEGFP的构建

以质粒pCMV－rFoxA1为模板，以上游引物5′－CGC GGATCC ATGTTAGGGACTGTGAA G－3′，下游 引 物 5′－CACGATTTATGA AGGATC AGATCT TGC－3′扩增全长大鼠FoxA1的cDNA序列，再克隆到plv－EGFP质粒上，经测序分析（上海生工）证实其正确性.

1.2.2 细胞培养与转染

293T细胞于完全培养基中生长，即DMEM、10%的胎牛血清、1%青链霉素，细胞长至80%～90%汇合即……