产二甲苯单加氧酶菌株的筛选、鉴定及转化2,5-二甲基吡嗪条件的优化

刘丽娟,薛亚平,郑裕国

(浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江 杭州 310014)

5-甲基吡嗪-2-羧酸是一种重要的医药中间体，可用于合成第二代口服降血糖药物格列吡嗪(Glypizide)、新型抗高血压药物阿西莫司(Acipimox)、抗结核药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等。目前，5-甲基吡嗪-2-羧酸工业生产方法有化学合成法和生物合成法，其中化学合成法存在过程复杂、选择性差、产率低、产物难分离、污染严重等缺点[1～8]，而生物合成法因具有高效、高选择性、条件温和、环境友好等特点，近年来得到快速发展。研究表明，单加氧酶可以对吡嗪等杂环类化合物进行高效、高区域性的加氧反应。研究者陆续筛选出Ralstonia/Burkholderiasp.DSM6920[9]、RhodococcuserythropolisDP-45[10]、Pseudomonasputida[11，12]等具有单加氧酶活性的菌株，其中恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)能够选择性地将2,5-二甲基吡嗪对称甲基中的一个甲基氧化为羧基[11]，且具有很强区域选择性，在5-甲基吡嗪-2-羧酸的生产中应用潜力巨大。瑞士的Lonza公司利用含二甲苯单加氧酶的菌株在批次补料反应器中实现了5-甲基吡嗪-2-羧酸的微生物法生产[13]。目前，国内还未见这方面的研究和报道。

作者从土壤中筛选出一株产二甲苯单加氧酶菌株，可以有效地将2,5-二甲基吡嗪氧化为5-甲基吡嗪-2-羧酸，对其进行生理生化鉴定及16S rDNA分析，并对转化条件进行了优化。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

从化工厂的排污口附近、菜园、果园、植物丛等处采集100余份土样用以菌种筛选。

Biolog(GEN Ⅲ)微生物自动鉴定专用试剂及培养基等，Biolog公司；基因组DNA快速提取试剂盒，MP Bio公司；DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒，Axygen公司。……