裙带菜多糖对人外周血单个核细胞的免疫活性作用

高淑清，张 辉，邸红琴，赵连梅，单保恩

(1河北医科大学第四医院，石家庄 050011;2河北省胸科医院)

裙带菜(Undaria pinnatifida)是生活在海洋里的大型藻类，含有亚油酸和亚麻酸等人体必需的脂肪酸。近几年的药理研究表明裙带菜多糖具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等多种生物活性［1］，显示了其潜在的应用价值，但对其免疫调节机制尚不十分清楚。2006年10月～2008年3月，我们观察了裙带菜多糖对正常人外周血淋巴细胞增殖、淋巴细胞亚群等的影响，探讨其免疫机制，旨在为临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料 CO2培养箱(TC 2323型)为美国SHELDON公司产品，倒置相差显微镜(LH50A型)使用日本OLYMPUS公司产品，酶标仪(HT2型)为奥地利Anthos公司，流式细胞仪(EPICS-XL型)使用Coulter Co.Healeah，FL产品。无菌培养板为美国Costar公司产品，Lymphocytes separation medium使用上海恒信化学试剂公司产品，MTT、DMSO和PHA购自Sigma公司，胎牛血清购自四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640使用美国GIBCO公司产品，淋巴细胞亚群流式检测试剂盒购自CALTAGTM Laboratories公司。取10例健康志愿者静脉血5mL，肝素抗凝备用。

1.2 方法

1.2.1 裙带菜多糖提取物制备 采用多步分离法［2～4］对裙带菜多糖的有效成分进行分离:首先用乙醇沉淀法提取粗多糖，然后应用葡聚糖凝胶Sephadex G-100过滤层析技术对粗多糖进行分离纯化。采用苯酚—硫酸显色法鉴定纯化的多糖成份。得到单一的对称峰(见图1)，说明最终所得提取物为纯多糖。

图1 裙带菜多糖粗提液经Sephadex G-100洗脱后的多糖含量曲线

1.2.2 PBMC分离 采用Ficoll密度梯度离心法。取5 mL肝素抗凝静脉血与等量PBS液混匀，缓慢加于5 mL Ficoll淋巴细胞分离液面上，2 000 r/min离心20 min。取淋巴细胞加PBS液，1 500 r/min离心10 min，洗涤细胞2次。用含10%小牛血清的RPMI1640重悬细胞。用台盼蓝染色，计数淋巴细胞。活细胞百分率(%)=活细胞数/总细胞数×100%

1.2.3 PBMC干预及增殖活性检测 取分离的PBMC，调整细胞浓度为21×106/mL，接种于96孔培养板，100 μL/每孔。每孔加入 PHA 1 μL(1 mg/mL)，使各孔PHA终浓度为5 μg/mL。观察组分别加入0.5、5、20、100、500 μg/mL 的裙带菜多糖，各设三个复孔;对照组仅加入PBS。用RPMI1640调整每孔终体积为200 μL。将培养板置于饱和湿度、5%CO2培养箱中37℃培养72 h。各培养孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL，继续培养4 h。弃去培养上清，每孔加入 DMSO 100 μL，振荡器震荡反应 15 min。用酶联免疫检测仪以测定波长570 nm检测各孔光密度(OD)值。

1.2.4 PBMC干预及淋巴细胞亚群表达检测 取分离的PBMC，调整细胞浓度为1×106/mL，加入细胞培养瓶中，每瓶 2 mL。分别加入 0、0.5、5、20、100、500 μg/mL 的裙带菜多糖 25 μL。同时，每瓶各加 PHA 5 μL(1 mg/mL，终浓度为 1 μg/mL)，用RPMI1640补足每瓶终体积为5 mL。于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h，收获各培养瓶中的细胞，用0.01 mol/L PBS洗1遍，调整细胞浓度为51×106/mL，用流式细胞仪检测PBMC中淋巴细胞亚群。

1.3 统计学方法 采用SPSS14.0统计软件对所有数据进行统计分析，实验结果±s表示，组间比较采用成组设计的两样本均数比较的t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC 增殖活性 观察组 0.5、5、20、100、500 μg/mL 干预后OD 值分别为0.136 ±0.036、0.191 ±0.023 、0.216 ± 0.007、0.193 ± 0.009、0.165 ±0.012，与对照组(0.106 ±0.006)比较，P 均 ＜0.01。2.2 淋巴细胞亚群 见表1。

表1 两组淋巴细胞亚群水平(n=10，%，±s)

表1 两组淋巴细胞亚群水平(n=10，%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01;与0.5 μg/mL 比较，▲P ＜0.05

组别 CD4+ CD8+ CD19+ CD16+CD56+观察组0.5 μg/mL 49.50 ±1.80 24.67 ±1.53* 3.80 ±1.53 4.17 ±0.76 5.0 μg/mL 49.60 ±1.76 30.87 ±2.08△▲3.33 ±2.08 9.33 ±1.53△▲20.0 μg/mL 48.98 ±3.21 34.67 ±2.52△▲3.67 ±1.53 9.67 ±1.53△▲100.0 μg/mL 49.31 ±4.53 28.33 ±2.10△▲3.68 ±2.00 6.70 ±1.44△▲500.0 μg/mL 48.99 ±2.62 28.10 ±5.00＊▲3.80 ±2.69 5.50 ±1.80△对照组49.30 ±4.00 21.33 ±4.04 3.78 ±2.00 3.01 ±1.73

3 讨论

裙带菜为褐藻门昆布属，是经济价值和药用价值较高的大型藻类，营养丰富。裙带菜孢子叶含人体必需的八种氨基酸及亚油酸、亚麻酸等人体必需的脂肪酸(其中二十碳五烯酸占脂肪酸含量的15% ～20%)。另外，裙带菜富含钙、镁、铁等多种无机元素，是人体所需要的重要营养物质。被誉为海中的蔬菜、餐桌上的绿色保健食品。本研究采用多步分离法分离纯化了裙带菜多糖活性成分，裙带菜多糖作为裙带菜中的重要活性成分，研究其免疫学活性及作用机制具有十分重要的意义。本研究显示，裙带菜多糖可明显增强PHA刺激的PBMC增殖，在一定浓度范围内，随裙带菜多糖浓度的增加，PBMC增殖反应逐渐增强。但当裙带菜多糖浓度增加到一定值时(100 μg/mL)，PBMC增殖又逐渐减弱。这可能是由于淋巴细胞在高浓度的裙带菜多糖环境下，受到来自渗透压、pH等的不利影响，而使细胞受到损害，从而影响细胞的存活和增殖。与以往的报道一致［5］。

CD8+T细胞主要包含两类细胞即Ts细胞(抑制性T细胞)和CTL(杀伤性T细胞)。Ts细胞作用的靶细胞主要是抗原特异性的Th和B细胞，其作用除了引起细胞免疫应答外，还可抑制B细胞产生抗体;CTL的主要生物学主要为参与细胞免疫、抗肿瘤免疫及移植排斥反应。NK细胞是一种非特异性、具有细胞毒性的免疫细胞群，在宿主的免疫监视功能中具有重要作用。该细胞无需抗原预先致敏，就能自发地杀伤靶细胞，主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫、抗病毒感染中均起重要作用。NK细胞的抗肿瘤活性依赖KIR区域和TRAU区域介导肿瘤细胞凋亡，这两个激活和抑制性受体的调节和平衡是肿瘤免疫治疗的基础［6］。Maruyama 等［7］对裙带菜孢予叶中提取的岩藻聚糖进行研究，结果发现岩藻聚糖糖能够提高Thl细胞应答及IFN-γ和IL-12产生，从而介导细胞免疫反应。本研究结果显示，裙带菜多糖刺激PBMC增殖后，各淋巴细胞亚群的表达发生明显改变。其中CD8+T细胞、NK细胞比例明显增高，CD4+T细胞虽有增加趋势，但与对照组比较无显著性差异，B细胞无明显变化。提示裙带菜多糖通过增强细胞免疫而非体液免疫功能发挥免疫作用。

综上所述，裙带菜多糖能够促进人PBMC淋巴细胞增殖并对淋巴细胞亚群水平产生有益的影响。增强细胞免疫功能可能是裙带菜多糖治疗肿瘤机制之一。关于裙带菜多糖对细胞因子分泌、体液免疫功能的影响、体内作用效果、抗肿瘤作用等有待于进一步研究。

［1］付小梅，高淑清，孙侠，等.裙带菜的生理药理作用研究进展［J］.癌变·畸变·突变，2004，16(4):254-256.

［2］王北婴，李仪奎.中药新药研制开发技术与方法［M］.上海:上海科学技术出版社，2001:735-749.

［3］李亚清.小球藻多糖的分离纯化和组成分析［J］.大连水产学院学报，2006，21(3):56-59.

［4］周文兰，童列波.苯酚—硫酸法测定康克胶囊中多糖含量［J］.时珍国医国药，2001，12(7):505.

［5］胡国俊，白惠卿，杜守英.枸杞对TB淋巴细胞增殖和T细胞亚群变化的调节作用［J］.中国免疫学杂志，1995，11(3):163-165.

［6］Klinge N，Mann H，Boissel L.Targeted cellular therapy with natural killer cells［J］.Horm Metab Res，2008，40(2):122-125.

［7］Mamyama H，Tamauehi L，Hashimoto M，et al.Antitumor activity and immune response of mekabu fueoidan extracted from sporophy U of undaria pinnatifida［J］.In Vivo，2003，17(3):245.