银杏叶提取物对活化血小板刺激人冠状动脉内皮细胞产生ROS以及表达LOX－1和磷酸化p38MAPK的影响

朱贤关 李忠东 王建昌 孟如松 (安徽医科大学研究生学院，安徽 合肥 0000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发病机制有多种学说，如损伤反应学说、AS氧化学说(oxidative hypothesis)等，实验证明，他汀类、阿司匹林、维生素E和C等和某些中药通过抗氧化作用，阻断AS的发展。银杏叶提取物(EGb)是天然中草药银杏叶的提取物，主要成分有黄酮类、萜类、原花色素类以及其他未知成分〔1〕。研究证明，该药治疗心脑血管疾病作用机制主要是抑制体内自由基〔2〕和血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的产生〔3〕。本文观察活化血小板与内皮细胞上的脂氧合酶同工酶(LOX－1)受体结合后对自由基产生的影响，并分析丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化通路产生炎症因子的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人冠状动脉内皮细胞(human coronary endothelial cells，HCAECs)。购自 ScienCellTM实验室(ScienCellTMResearch Laboratories);血小板，健康成年志愿者，抽血前2 w内未吸烟，未服用任何抗血小板药物。

1.1.2 药物、试剂及仪器 EGb(中国药品生物制品检定所);二氯二氢荧光素二乙酯(2′，7′－dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF－DA)探针(Invitrogen 公司)，小鼠抗人 LOX－1 单抗(R＆D systems公司)，小鼠抗人 p－p38MAPK 单抗(Santa Cruz公司)，小鼠抗人 β－肌动蛋白(β－actin)抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠抗体(中杉金桥)。离心机，荧光显微镜，温箱。

1.2 方法

1.2.1 活化血小板制备 健康成年志愿者，抽血前2 w内未吸烟，未服用任何抗血小板药物。未扎止血带抽取新鲜静脉血20 ml，注入含有3.8%枸橼酸钠(1∶9)抗凝溶液的聚丙乙烯试管内，上下颠倒轻摇充分混匀;立即室温下1200 r/min离心5 min，收集富集血小板血浆(platelet－rich plasma，PRP);PRP 室温下3000 r/min离心15 min，沉淀血小板用台式缓冲液洗涤2次，并复悬于台式缓冲液，调整血小板计数为2×108/ml〔1〕。加入终浓度为5 μmol/L的ADP，轻摇充分混匀20 min，即为活化血小板，备用。……