高效液相色谱法测定饲料中的氨基酸

(天津博纳艾杰尔科技有限公司，天津300462)

氨基酸对动物的生长、神经系统的发育及动物体内营养物质的正常代谢都有重要的作用，而且蛋白质是动物生长必需的营养物质，是评价饲料营养成分的一个指标，而氨基酸是构成蛋白质的基本单位，所以氨基酸的种类和含量也就是评价饲料质量的根本依据，从而准确检测氨基酸的含量和种类具有重要意义。柱后衍生的方法，虽然准确性高，但是耗时长、灵敏度低，所以本文采用柱前衍生的方法以缩短分析时间，增加灵敏度。同时该方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存数月，克服了柱前衍生法衍生物不稳定的缺点，另外该方法准确性高，用标准品做未知样品进行检测，检测的含量与标准品的标示值非常接近。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要仪器

饲料样品1与样品2为市售两种不同品牌的饲料；Venusil AA氨基酸分析方法包(含衍生试剂PITC、氨基酸标准品、Venusil AA氨基酸分析专用柱4.6 mm×250 mm，5 μm)购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；氨基酸标准品(sigma公司)；水(屈臣氏4 L纯净水)、乙腈(色谱纯，霍尼韦尔)；Agilent 1100高效液相色谱仪(包括紫外可变波长检测器和高压输液泵)。

1.2 样品前处理

酸水解法：准确称取一定量的样品，使样品氨基酸总量在50～75mg范围内，置于20～30 ml安瓿瓶中，加入10 ml含0.1%苯酚的6 mol/l盐酸，振摇使样品溶解或者是样品均匀分散在溶液中，将安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷冻3～5 min，充氮后用喷灯熔封，然后置于(110±1)℃烘箱中水解24 h，取出冷却，取水溶液1 ml，置于浓缩管中用浓缩仪浓缩至干，加入1 ml的0.1 mol/l稀盐酸溶解，用0.45 μm滤膜过滤后，取上清液贮存于冰箱中，供衍生使用。

1.3 衍生方法

准确量取水解后溶液及氨基酸标准品200 μl，分别置于1.5 ml离心管中，往每只离心管中准确加入正亮氨酸内标50 μl，然后分别加入三乙胺乙腈溶液100 μl和异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，摇匀室温静置衍生1 h。衍生结束后分别加入400 μl正己烷，振摇并静置10 min，取下层溶液200 μl并用水稀释到1 ml，混合均匀后用0.45 μm针式过滤器过滤即可。

1.4 检测方法

1.4.1 溶液配制

流动相A：称取15.2 g无水乙酸钠,加水1 850 ml，溶解后用冰醋酸调pH值到6.5,然后加乙腈溶液140 ml,混合均匀并用0.45 μm滤膜过滤。

流动相B：80%乙腈水溶液。

1.4.2 高效液相检测条件

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪；

色谱柱：Venusil AA氨基酸分析专用柱4.6 mm×250 mm，5 μm，100 A；

流速：1 ml/min；

进样量：10 μl；

检测波长：254 nm；

柱温：40℃；

检测梯度见表1。

表1 流动相梯度变化

2 实验结果与讨论

2.1 液相条件的建立

样品中氨基酸含量比较低，而且直接检测溶剂效应较大，经过衍生后直接检测样品中的氨基酸不能完全分离，本文通过用水稀释衍生溶液的方法降低检测中的溶剂效应，并且经过优化流动相梯度使18种氨基酸得到良好的分离。

但是实际检测过程中相同的检测条件下，仪器不同，分离效果差别较大，有的甚至都完全分不开，为此本文还开发了一种基础检测条件，可以根据仪器的自身特点，稍加调整流动相的比例即可使18种氨基酸得到较好的分离。基础检测条件如表2所示。

表2 流动相基础梯度变化

2.2 检测方法的稳定性、线性及准确性

氨基酸标准品按照1.3节方法衍生后，相同的条件（1.4.2节）下连续重复进样6次，计算相对标准偏差，结果如表3所示。由结果可知该方法比较稳定，可以用来检测氨基酸样品，其实验图谱如图1所示。

表3 氨基酸的线性回归方程、标准偏差和检出限

根据仪器对各个物质的响应情况，将氨基酸标准溶液分别稀释成2.5 μmol/ml(胱氨酸为1.25 μmol/ml)、1.25 μmol/ml（胱氨酸为 0.625 μmol/ml）、0.5 μmol/ml（胱氨酸为 0.25 μmol/ml）、0.25 μmol/ml(胱氨酸为0.125 μmol/ml)、0.125 μmol/ml(胱氨酸为0.0625 μmol/ml)5个浓度，然后按照1.3节的衍生方法同时衍生处理，样品经稀释过滤后在相同的实验条件下（1.4.2节）进样，依据进样浓度X（μmol/ml)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，根据各个物质峰高、噪音，遵循S/N=3计算出最低检出限，回归方程及检出限见表3。可见，在选定的液相色谱条件下氨基酸标准溶液的响应与浓度呈良好的线性关系。

图1 氨基酸标准偏差试验色谱

为了验证建立方法的准确性，本文用Sigma氨基酸标准品为样品，以博纳艾杰尔科技的标准品为标准品通过相同的方法（1.3节）衍生后，按照相同的条件（1.4.2节）检测得出检测值与标示值之间的偏差，除胱氨酸外，偏差均小于3%，接近标准品的标示值，证明该方法准确性高，检测效果稳定。实验结果如表4。

表4 检测Sigma标准品的相对误差

因为半胱氨酸在碱性环境下能够转化成胱氨酸，所以经碱水解后胱氨酸的含量不稳定，此外有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联，经异硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不稳定，非常容易分解，所以胱氨酸的相关系数和偏差都比较大。

2.3 样品检测结果

按照上述方法检测处理后的饲料样品可得色谱图如图2、图3，通过单点校正法可以得出样品1和样品2中含有标准品中的17种氨基酸。

样品中的17种氨基酸均能得到良好的分离，这说明在有基质干扰的情况下本文建立的这种方法同样适用，而且样品连续进样重复性非常好，未出现样品变质或者峰型变差的现象，证明本文建立的方法在有基质干扰的情况下也同样克服了衍生氨基酸容易分解的问题。

3 实验结论

按照上述实验条件，可以准确检测饲料样品中17种氨基酸，同时检测的灵敏度及线性都能满足检测的要求，而且本方法准确性高，与样品中含有氨基酸的真值偏差非常小，所以该方法可以准确的检测饲料样品中的氨基酸。

图2 实际样品1色谱

图3 实际样品2色谱

[1]胡鑫鹦,盛翠凤.浅议饲料分析的高效液相色谱法[J].科技资讯,2008,28(2):221.

[2]瞿其署,汤晓庆,胡效亚,等.柱前衍生法在氨基酸分析中的应用[J].化学进展，2006,18（6）：789-793.

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[4]中华人民共和国国家标准饲料中氨基酸的测定.