不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成的研究

李雅娟钱聪印杰高敏高养春刘博王玉生

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.湖北省水产科学研究所,湖北武汉430071)

不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成的研究

李雅娟1,钱聪1,印杰2,高敏1,高养春1,刘博1,王玉生1

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.湖北省水产科学研究所,湖北武汉430071)

以泥鳅Misgurnusanguillicaudatus为研究对象,通过染色体计数法,对二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正交 (2n×4n)、反交 (4n×2n)杂交后代的早期胚胎、6月龄及12月龄阶段的染色体数目进行了统计分析。结果表明:早期胚胎正、反杂交后代的染色体数目为67～81、67～82,在良好的中期分裂相 (100、100个)中,染色体数目为75的整三倍体众数百分比最高 (22%,20%),此外还有大量染色体数目＜75的亚三倍体 (37%,51%)和染色体数目＞75的超三倍体 (41%,29%);6月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～79、66～80,在良好的中期分裂相 (58、63个)中,整三倍体 (3n=75)众数百分比最高(26%,41%),此外还有大量亚三倍体 (34%,49%)和超三倍体 (40%,10%);12月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～82、69～83,在良好的中期分裂相 (71、50个)中,三倍体 (3n=75)众数百分比最高 (28%,54%),此外还有大量亚三倍体 (48%,20%)和超三倍体 (24%,26%)。研究表明,二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正、反杂交后代均出现大量能存活的非整三倍体个体,并随养殖时间的延长,非整三倍体率呈下降趋势。

泥鳅;正、反杂交三倍体;染色体数目;非整三倍体

鱼类多倍体育种是基于染色体组操作基础上发展起来的育种技术,也是水产界长期以来追踪研究的热点。一般认为,不育的三倍体鱼能将性腺发育的能量转化为肌肉生长的能力,使其具有潜在的生长优势。另外,三倍体鱼的不育性对控制养殖鱼类的过度繁殖和保护天然种质资源也具有极其重要的意义,而且三倍体鱼还可以作为转基因鱼的理想载体,解决转基因鱼的生态安全问题[1]。鉴于三倍体鱼的各种优势,制备三倍体鱼也成为广大研究者追求的目标。自20世纪50年代以来,三倍体诱导技术已在鱼类遗传育种领域得到较广泛的应用,国内外已先后在三棘刺鱼[2]、 鲤[3]、 水晶彩鲫[4]等30多种鱼类育种中成功获得三倍体,其中三倍体异育银鲫[5]、湘云鲫[6-7]、湘云鲤[8]等已进行商品化生产,达到了产业化水平。三倍体技术在生产上发挥着越来越重要的作用。

人工诱导鱼类三倍体的方法主要有两条途径:一条是直接途径,即用物理或化学的方法对受精卵进行处理,抑制第二极体释放,形成三倍体;另一条是间接途径,即首先诱导获得四倍体,待四倍体个体性成熟后再与二倍体个体自然交配,获得杂交三倍体[9]。间接途径避免了繁琐的人工处理操作程序及理化诱导手段可能对受精卵造成的伤害,提高了三倍体孵化率。因此,利用天然四倍体与二倍体杂交制备新型的杂交三倍体是实现鱼类产业化生产的一条切实可行的途径,具有良好的应用前景。

三倍体率是否稳定,关系着能否发挥三倍体养殖优势的关键。李雅娟等[10-12]通过对中国长江流域特有的天然四倍体泥鳅的起源及形成机制进行研究,证实了天然四倍体泥鳅是遗传四倍体 (4n= 100),雌、雄泥鳅均能产生正常的2n配子,并对四倍体泥鳅与二倍体泥鳅杂交子代的倍性进行了初步探讨。贾光风等[13]对天然四倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交子代的染色体带型及荧光原位杂交进行了分析,为杂交子代三倍体提供了分子细胞学证据。方礼豹等[14]对不同倍性泥鳅与大鳞副泥鳅杂交子代进行了DNA相对含量的测定和染色体组型的分析。但关于杂交子代染色体组成及稳定性的研究目前尚未见报道,为此,本研究中作者以泥鳅Misgurnusanguillicaudatus为研究对象,对二倍体泥鳅(雌、雄)与天然四倍体泥鳅 (雌、雄)正、反杂交后代的染色体数目组成及其稳定性进行了研究,旨在为杂交三倍体泥鳅染色体组稳定性提供细胞学证据,并为中国三倍体鱼类的产业化探索一条高效易行的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

天然四倍体泥鳅 (4n=100)6尾 (雌3尾,雄3尾),取自湖北省赤壁市,二倍体泥鳅 (2n= 50)6尾 (雌3尾,雄3尾),购于大连市农贸市场,体长为11.4～18.6 cm,体质量为 10.15～63.13 g,暂养于大连海洋大学细胞遗传与工程实验室的水族箱中,暂养温度为 (22±1)℃。

1.2 方法

1.2.1 倍性检测及杂交三倍体泥鳅的制备 运用红细胞核体积测量法对湖北省赤壁市收集的野生泥鳅53尾及大连当地的二倍体泥鳅进行倍性检测,筛选出四倍体泥鳅15尾 (雌9尾,雄6尾)和二倍体泥鳅10尾 (雌6尾,雄4尾),具体方法参照文献 [15]。

于2010—2011年,在筛选出的15尾四倍体泥鳅和10尾二倍体泥鳅中选择性腺发育良好的天然四倍体泥鳅6尾 (雌、雄各3尾)与二倍体泥鳅6尾 (雌、雄各3尾)进行杂交,人工催产,干法受精,配置2n♀ ×4n♂和4n♀ ×2n♂杂交组合,每个组合设3个平行。泥鳅孵化和幼鱼培育温度为(25±1)℃,每天换水两次,保持室内空气新鲜和流通。

1.2.2 早期混合胚胎染色体标本的制备 当胚胎发育到眼胞期时,在解剖镜下剥去卵膜和卵黄,正交组合剥46个胚胎,反交组合剥52个胚胎,将两种组合的胚胎分别放入盛有体积分数为0.0025%的秋水仙素溶液中处理45 min,用体积分数为0.8%的柠檬酸钠低渗20 min后,再用卡诺固定液(φ(甲醇) ∶φ(冰醋酸)=3∶1)固定,冷冻过夜;冷滴片,用体积分数为10%的Giemsa染色液染色,镜检并拍照。

1.2.3 鳃细胞染色体标本的制备 采用稍加修改的PHA体内二次注射法[16]以及快速制备鱼类染色体的方法制备鳃细胞染色体标本[17]。具体操作如下:将每尾鱼活体腹腔注射PHA溶液,剂量为6 μg/g(鱼体质量),18～20 h后第二次注射同样剂量的PHA,4～6 h后活体腹腔注射体积分数为0.1%的秋水仙素溶液,剂量为6μg/g(鱼体质量),作用2～3 h后,解剖取鳃。将鳃用体积分数为0.8%的柠檬酸溶液2 mL在室温下低渗40～45 min,再用卡诺固定液固定3次,每次15 min,采用空气干燥法制备染色体标本,然后用体积分数为10%的Giemsa染色液染色1～2 h,用自来水冲洗,自然风干,镜检并拍照。

2 结果

2.1 正、反杂交三倍体泥鳅早期胚胎、6月龄及12月龄3个阶段的倍率变化

从表1可见:正交杂交三倍体泥鳅早期胚胎、6月龄及12月龄3个阶段的整三倍体率分别为22%、26%和28%,反交杂交三倍体泥鳅3个阶段的整三倍体率分别为20%、41%和54%;正交杂交三倍体泥鳅3个阶段的非整三倍体率分别为78%、74%和72%,反交杂交三倍体泥鳅3个阶段的非整三倍体率分别为80%、59%和46%。明显看出,正、反杂交整三倍体率都随养殖时间的延长逐渐增加,而非整三倍体率则随养殖时间的延长而逐渐降低。

2.2 正、反杂交三倍体泥鳅早期胚胎、6月龄及12月龄3个阶段染色体的组成

2.2.1 早期胚胎染色体的组成 正交 (2n×4n)组后代的46个胚胎100个良好的中期分裂相中,染色体数目为67～81,其中有染色体数目3n=75的整三倍体22个,众数百分比最高,为22%(表1,图1-A,图2-A),即25条源于母本,50条源于父本,为典型的杂交三倍体;此外,还有37%染色体数目3n＜75的亚三倍体 (表1,图2-B)和41%染色体数目3n＞75的超三倍体 (表1,图2-C)。反交 (4n×2n)组后代的52个胚胎100个良好的中期分裂相中,染色体数目为67～82,其中有染色体数目3n=75的整三倍体20个,众数百分比最高,为20%(表1,图1-B,图2-D),即50条源于母本,25条源于父本,为典型的杂交三倍体;此外,还有55%的亚三倍体 (表1,图2-E)和29%的超三倍体 (表1,图2-F)。

2.2.2 6月龄染色体的组成 6月龄正交 (2n× 4n)组后代的11个个体58个良好的中期分裂相中,染色体数目为68～79,其中有染色体数目3n =75的整三倍体15个,众数百分比最高,为26% (表1,图1-C,图2-G);此外,还有34%的亚三倍体 (表1,图2-H)和40%的超三倍体 (表1,图2-I)。反交 (4n×2n)组后代33个个体63个良好的中期分裂相中,染色体数目为66～80,其中有染色体数目3n=75的整三倍体26个,众数百分比最高,为41%(表1,图1-D,图2-J);此外,还有49%的亚三倍体 (表1,图2-K)和10%的超三倍体 (表1,图2-L)。

表1 杂交三倍体泥鳅的染色体数目组成Tab.1 Chromosome numbers in the triploid loach by various crosses

图1 杂交三倍体泥鳅不同发育阶段的染色体数目Fig.1 Chromosome num ber in different developmental stages of the trip loid loach by various crosses

2.2.3 12月龄染色体的组成 12月龄正交 (2n× 4n)组后代12个个体71个良好的中期分裂相中,染色体数目为68～82,其中有染色体数目3n=75的整三倍体20个,众数百分比最高,为28%(表1,图1-E,图2-M);此外,还有48%的亚三倍体 (表1,图2-N)和24%的超三倍体 (表1,图 2-O)。反交 (4n×2n)组后代14个个体50个良好的中期分裂相中,染色体数目为69～83,其中有染色体数目3n=75的整三倍体27个,众数百分比最高,为54%(表1,图1-F,图2-P);此外,还有20%的亚三倍体 (表1,图2-Q)和26%的超三倍体 (表1,图2-R)。

图2 杂交三倍体泥鳅不同发育阶段的染色体中期分裂相 (比例尺为10μm)Fig.2 M etaphase cells in different developm ental stages of the trip loid loach by various crosses(Bars=10μm)

3 讨论

3.1 杂交三倍体泥鳅的倍率变化及染色体组成

理论上四倍体与正常二倍体杂交时,四倍体产生2n配子,二倍体产生n配子,二者杂交形成的后代染色体数目应该是3n。据报道,泥鳅二倍体的染色体数目为2n=50,泥鳅四倍体的染色体数目为4n=100[18-21],二者杂交时,四倍体产生二倍体配子 (2n=50),二倍体产生单倍体配子 (n= 25),杂交后代染色体数目应为3n=75。但在本试验中,除有染色体数目为3n=75的整三倍体外,还发现大量的非整三倍体 (3n＜75或3n＞75)存在,而且不同发育阶段非整倍体所占比例也不同,正交组 (2n×4n)早期胚胎、6月龄和12月龄中非整三倍体所占的比例依次为78%、74%和72%,而整三倍体率依次为22%、26%和28%;反交组(4n×2n)早期胚胎、6月龄和12月龄中非整倍体所占的比例依次为80%、59%和46%,而整三倍体率依次为20%、41%和54%。由此看出,无论是正交,还是反交,非整三倍体所占的比例随养殖时间的延长呈下降趋势,而整三倍体率却随着养殖时间的延长呈上升趋势。关于三倍体倍率变化曾有一些报道,Muki等[22]对诱导过的三倍体菲律宾蛤子在养殖过程中三倍体率的变化进行了研究,结果表明三倍体率从最初的76%下降到最后的20%;杨爱国等[23]对栉孔扇贝的胚胎、D形初期幼虫和6～7 mm稚贝的三倍体率进行检测,结果发现D型幼虫的倍性与实际获得的三倍体基本相同,但与胚胎阶段的倍性并不存在可比性,不能代表成体的三倍体率;姜波等[24]发现2龄杂交三倍体太平洋牡蛎中存在15%的非整倍体,并推测造成杂交三倍体遗传稳定性低的原因,一方面可能是亲本之间的地域差异,另一方面相对于整三倍体,非整倍体的存在可能在遗传稳定性上更差,在发育的过程中更容易造成染色体的丢失。本研究中由于所采用的父母本分别来自湖北省赤壁市和大连市,亲本之间的地域差异可能是造成稳定性低的主要原因,这与姜波等[24]的推测一致。Allen等[25]认为三倍体的基因组是不稳定的,其原因可能是三倍体逐渐失去一套染色体组,形成嵌合体,进一步还原为二倍体。本研究中虽然没有按个体进行染色体数目分布的统计,但观察中发现同一个体不同细胞内染色体数目也存在多样性,其原因可能有两个方面,一是四倍体亲本产生了非整二倍体配子,二是滴片时染色体丢失,但在杂交三倍体泥鳅早期胚胎、6月龄和12月龄3个阶段中均未发现嵌合体和二倍体。本研究结果与Allen等的研究结果不太一致。

3.2 非整倍体泥鳅的存活及产生的原因

非整倍体是染色体数目变异的一种类型,非整倍体生物是指染色体组中增加或减少个别染色体的生物。最初,人们在月见草中发现了非整倍体[26],随着研究的进展,在人类、哺乳动物、植物、贝类中已有一些相关报道。史庆华等[27]报道了非整倍体可能会导致不育不孕、自发流产和先天出生缺陷。柳霖坡等[28]在对甘蓝异倍体间进行杂交时也发现很大比例的非整倍体。由于遗传上的不平衡,非整倍体个体一般生活力较低。在哺乳动物家畜中,非整倍体常常是使其致死或引起其发育障碍的因素之一[29-30],如人类21号染色体三体所导致的Down综合征,可引起人体全身多个组织和器官的疾病[31-32]。但是某些低等动物 (如贝类) 能耐受非整倍体的存在,已有的研究结果表明,在多种贝类中非整倍体个体是可以存活的。在太平洋牡蛎中至少已发现12种类型的非整倍体个体可以存活,并能正常生长,有的甚至能在某些方面表现出优势[33-34];在合浦珠母贝中也发现有5种非整倍体个体能够存活[35];在皱纹盘鲍中也发现了非整倍体个体[36]。在植物中,几乎所有主要农作物的种类都被建立了一整套的初级三体[24,36-40]。本研究中,无论正交还是反交产生的杂交三倍体泥鳅从养殖6月龄和12月龄中均发现了能够存活的非整倍体个体,说明利用天然四倍体泥鳅和二倍体泥鳅杂交制备的杂交三倍体在养殖生产上具有一定的推广价值。这与Zhang等[30]报道的超三倍体泥鳅能够存活的结果一致。尽管非整倍体在贝类中是可以存活的,但非整倍体对贝类的生长和存活也有一定的影响。王昭萍等[38]研究发现,从胚胎到成贝 (1周年)非整倍体个体的存活率仅为整三倍体个体的61%。本研究结果表明,随着养殖时间的延长,非整倍体比例有下降趋势,可能是非整倍体个体存活率低的原因,与王昭萍等[38]的研究结果相同。

非整倍体的产生,主要是细胞减数分裂时偶然发生的染色体不配对、不分离或分离延迟等,形成比正常配子 (n)多一条染色体配子 (n+1)和比正常配子 (n)少一条染色体配子 (n-1)。这些配子与正常配子结合或它们之间相互结合时,形成各种非整倍体[41]。对于四倍体与二倍体杂交产生非整三倍体的原因也有不少研究。Guo等[42]在研究太平洋牡蛎四倍体的性腺发育和减数分裂后,认为四倍体后代中非整倍体数量增加是因为减数分裂中同源染色体的不完全配对形成单价体和三价体的结果;王昭萍等[24]在二倍体与四倍体杂交产生的三倍体牡蛎群体中检测到了非整倍体,也认为非整倍体的产生是由于其四倍体父本在精子的发生过程中减数分裂发生失误,形成三价体或单价体,产生了非整倍体的精子造成的;本研究中通过染色体计数法在杂交三倍体泥鳅不同发育阶段都检测到了非整倍体,而且非整倍体所占比率很高;李雅娟等[10]对天然四倍体泥鳅雌、雄生殖细胞染色体的减数分裂行为进行了研究,发现天然四倍体泥鳅中雌、雄个体均由0～6个四价染色体和38～50个二价染色体组成。四价体的存在为天然四倍体泥鳅产生非整倍体配子提供了细胞遗传学证据。因此,这些非整倍体可能是四倍体父母本在减数分裂过程中,四价染色体不均衡分离而产生非整倍体配子所致。今后可通过检测四倍体父母本所产生精子、卵子的染色体数目来证明四倍体父母本所产生配子的倍性。

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The chromosome sets stability of hybrid progeny in different ploidy loach

LIYa-juan1,QIAN Cong1,YIN Jie2,GAO Min1,GAO Yang-chun1,LIU Bo1,WANG Yu-sheng1
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,
Dalian 116023,China;2.Hubei Fisheries Science Researc Institute,Wuhan 430071,China)

The early embryo,and 6-month old and 12-month old reciprocal crossed triploid progenies were obtained through the cross of diploid loach and natural tetraploid loach(original crossed 2n×4n,reciprocal crossed 4n ×2n),and these six hybrid groupswere studied in this article.According to themethod of chromosome counting, the chromosome amounts of these hybrid triploid progenieswere counted and analysed.Consequently,the chromosome number of early embryonic cells of original crossed and reciprocal crossed progenies ranged from 67 to 81,67 to 82.The percentages of the number of triploid's chromosome(3n=75)were 22%and 20%in one hundred well metaphases of the early embryonic cells.And thiswas the highest percent compared with other chromosome number in the same group.In addition,the hypo-triploid(3n＜75)(37%,51%)and hyper-triploid(3n＞75)(41%, 29%)were found largely.The chromosome number of 6-month original crossed and reciprocal crossed progenies were in the range of68 to 79,66 to 80.Itwas also themaximal percentage(26%,41%)in their respective group when the number of triploid's chromosome was 75.Moreover,massive hypo-triploid(34%,49%)and hypertriploid(40%,10%)were discovered.The chromosome quantities of 12-month original crossed and reciprocal crossed progenies varied from 68 to 82,69 to 83.Similarly,the percentage of the chromosome number(3n=75) was also higher than others in each group(28%,54%).There were also findingsmany hypo-triploids(48%, 20%)and hyper-triploids(24%,26%).The findings showed that the reciprocal crossed triploid progenieswere obtained through the hybridization of diploid loach(female and male)and natural tetraploid loach(male and female)were found lots of non integral triploid survived,the percentage of non integral triploidswere downtrend with the prolonging cultural period and the percentage of original crossed non integral triploid wasmore than the percentage of reciprocal crossed non integral triploid.

Misgurnusanguillicaudatus;reciprocal cross triploid;chromosome number;nonintegral triploid

S917;Q813.4

A

2012-06-17

国家自然科学基金资助项目 (31272650);辽宁省科学技术基金资助项目 (201102019);大连海洋大学博士启动基金资助项目(017208)

李雅娟 (1961-),女,教授。E-mail:liyajuan@dlou.edu.cn

2095-1388(2012)04-0326-07