基质金属蛋白酶－2组织抑制剂基因多态性与蛋白质表达的关系

王 伟，徐 敏

(1.咸宁学院临床医学院内科学教研室，湖北咸宁437100;2.湖北省鄂钢医院)

蛋白酶/抗蛋白酶失衡假说已成为公认的与肺疾病(如慢性阻塞性肺病、肺纤维化等)发病有关的机制之一［1］。有研究显示［2］，TIMP－2 基因 +853位点多态性与慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的易感性有关，特别是当吸烟者存在等位基因G时易患COPD。本研究通过分析肺组织中TIMP－2基因多态性的改变与蛋白质表达的关系，进一步探讨TIMP－2基因多态性的改变在COPD发病中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象

选择肺大泡、肺癌手术切除的无病变肺组织29份，其中肺大泡7例、肺癌22例，标本立即置于－70℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 组织基因组DNA提取

取冻存的肺组织标本30mg，采用组织DNA提取试剂盒(美国Omega公司)提取组织基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链反应

引物(北京博大泰克公司合成):上游:5＇－GCCCAGGGTGTTCTGGATGG－ 3 ＇，下 游:5 ＇－CTCCGGCTGATGGCCCCACT－3＇，PCR 反应体系为 50μl，取洁净 PCR管依次加入 10×buffer 5μl，dNTP(10mmol/L)2μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，上游引物(10mmol/L)1μl，下游引物(10mmol/L)1μl，模板DNA 2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)2U(Promega公司提供)，ddH2O 35.6μl，PCR 反应条件:预变性94℃ 3min;变性 94℃ 45s;退火 66℃ 45s;72℃1min;共30个循环;再72℃延伸10min。

1.2.3 酶切反应

采用内切酶BsrI(NEB公司)对+853位点PCR产物进行酶切，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳，染色，在凝胶成像系统分析结果确定基因型。

1.2.4 TIMP－2 蛋白的检测

免疫组化SP法检测肺组织TIMP－2蛋白的表达:鼠抗人TIMP－2单克隆抗体，免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，标本经10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，包埋组织标本作5μm连续切片，采用高温直接煮沸法修复抗原，免疫组化SP法染色按照试剂说明书进行。用已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。……