脐带血间质干细胞生物学特性研究

王英 赵亚清 高洪泉 缪智辉 叶子坚

本文旨在探讨从人脐带静脉血是否可分离出基质干细胞，如果可以，确定它们的特性，方法是采用不支持造血干细胞生长的培养基培养脐血单个核细胞，对其生物学特性进行研究。

1 资料与方法

1.1 12份脐血采至厦门市中山医院，每份30～60ml。

1.2 基质细胞的分离与培养经新生儿父母同意，于厦门市中山医院采集正常足月新生儿脐带血12份，用L-DMEM培养液悬浮制备好的细胞，接种于25cm2培养瓶中培养。细胞达到70%汇合时进行传代。

1.3 形态学观察与生长曲线绘制 每日于倒置显微镜下观察细胞形态与增殖情况，拍照。对于脐血贴壁采用连续照相计数细胞数目21～30 d，描绘细胞生长曲线。

1.4 贴壁细胞鉴定 取第2代的脐带血基质干细胞，PBS液冲洗3遍，用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液消化后，1000 r/min离心10 min，用PBS冲洗，调节细胞浓度为1×105/ml，接种在放置有盖玻片的24孔板内，待细胞生长至融合状态时，取出盖玻片，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，而后按照试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，分为4份，分别滴加兔抗鼠 CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。1∶100稀释，加入50 ul于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜，隔天用PBS冲洗3次后，加入辣根过氧化酶标记的二抗50 ul，1∶200稀释，37℃作用2 h后，用PBS洗涤3次，用SABC显色试剂盒显色，倒置显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 脐血贴壁细胞形态学结果 12份脐血于细胞培养后48h在倒置显微镜下观察全部可见散在的单个贴壁细胞，数量较少，体积较其他细胞大，呈短梭形、针形或三角形，细胞边界折光性强。其中有6份脐血贴壁细胞增殖迅速，第5d时贴壁细胞呈克隆样生长，形成20～50个细胞的集落，并能维持成纤维细胞样形态(图1)，以后细胞数量继续增加，其中2例14～21 d细胞达80%汇合，4例30 d达70%汇合。……