大鼠PAX2真核表达质粒构建及瞬时转染肾小管上皮细胞模型建立

李 里，吴玉斌，宫 亮

(1辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州 121000;2中国医科大学附属盛京医院)

核转录因子(PAX2)基因编码核转录因子，是肾脏胚胎发育过程中诱导肾小管上皮细胞转分化的关键性发育基因之一，参与胚胎肾脏各个发育阶段的调控［1，2］，成熟肾单位其表达消失。研究表明，PAX2对单侧输尿管结扎(UUO)大鼠肾小管上皮细胞EMT有调控作用，参与肾间质纤维化的病理过程，但其调控机制的研究鲜有报道。我们采用基因重组技术构建大鼠真核表达质粒(PGC-FU)-PAX2真核表达质粒并立转染PGC-FU-PAX2使大鼠正常肾小管上皮NRK52E细胞中PAX2基因高表达，旨在为进一步研究PAX2对肾小管上皮细胞的转分化调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠10只(体质量120～150 g，鼠龄2～4周，购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心)，PCR引物:参考GenBank的PAX2基因序列设计出1对PAX2基因编码区扩增，引物序列:上游引物:PAX2-Age I-F GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGATATGCACTGCAAAG;下游引物:PAX2-Age I-R:TCACCATGGTGGCGACCGGGTGGCGGTCATAGGCAGC(上海吉凯基因化学技术有限公司合成)。引物说明:Age I酶切位点(下划线标记的)。载体克隆鉴定引物PAX2-F:CTGCATCTACCAACCCTG;PAX2-R:CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，408 bp。Trizol试剂(Invitrogen试剂公司提供);pGC-FU真核表达载体(上海吉凯基因化学有限公司)。本研究采用SPSS11.5统计软件行统计学处理，组间数据比较采用t检验。检验水准α=0.05。

1.2 PGC-FU-PAX2真核表达质粒构建 采用左侧输尿管结扎法制备肾间质纤维化模型(梗阻性肾病模型)造模21 d处死大鼠取左肾肾皮质总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增PAX2 cDNA片段，PCR 反应体系:引物 0.4 μmol/L，dNTP 1.6 mmol/L，5 × Taq buffer 4 μL，Taq 酶0.2，ddH2O 12.4 μL，Template 1 U;PCR反应条件:94℃预变性 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30 个循环;最后72℃、10 min，扩增PCR产物大小约1294 bp，取2～5 μL进行琼脂糖凝胶电泳分析;采用纯化试剂盒回收纯化PCR产物。……