支气管败血波氏杆菌外膜蛋白双向电泳图谱的建立

秦风彦，刘 燕，韦 强，肖琛闻，鲍国连*，季权安，姚火春

(1.浙江省农科院畜牧兽医研究所，浙江杭州310021；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095)

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)由Ferry于1922年首次从兔体中分离到，该菌可导致哺乳仔兔和断乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎，可以引起猪的萎缩性鼻炎、犬传染性支气管炎等，并且可以感染人，对养殖业危害严重并且具有重要的公共卫生学意义[1]。目前，预防该病的疫苗效果普遍不理想，丞待寻找新的疫苗候选成分。Bb的外膜蛋白(Outermembrane proteins，OMPs)在物质转运、信息识别、细胞吸附等方便具有重要的作用，具有良好的免疫原性，作为疫苗候选抗原具有良好前景[2-3]。双向电泳(2-DE)技术是根据蛋白质等电点和分子量不同，通过两次电泳进行蛋白分离，是对蛋白质组分辨率高、重复性好的分离技术。本研究利用碳酸钠法提取兔Bb的OMPs，采用2-DE提取的蛋白进行分离，通过对裂解液、上样量、聚焦条件等进行优化，获得了聚焦良好、分离清晰的Bb的OMPs图谱，为进一步研究Bb的OMPs奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 菌 株 Bb菌株由浙江省农科院畜牧兽医研究所分离、鉴定并保存。

1.2 主要试剂和仪器 IpG干胶条和IpG缓冲液(pH3～10、pH4～7)、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、CHAPS、蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor)、蛋白定量试剂盒均购自GE Healthcare公司；SB3～10购自Sigma公司；Ettan IPGphorⅢ等电聚焦仪、SE600Ruby标准垂直电泳系统、Image scanner扫描成像系统均为GE Healthcare公司产品。

1.3 样品制备 采用碳酸钠法提取OMPs[4-6]。Bb菌株划线接种于绵羊血平板，挑取单菌落至TSB中，37℃培养16h，4℃离心收集菌体，用预冷的低盐PBS洗4次，加入50mM pH7.5Tris-Cl重悬菌体，同时加入1%蛋白酶抑制剂，冰浴中超声裂解25m in(SONICSVC 750、2W、脉冲 2s、间隔 2s)，使OD600nm下降到初始值的1/l0。4℃ 9000r/min离心10m in取上清加入10倍体积冰预冷的0.1M Na2CO3(pH11)，冰浴中缓慢搅拌1h。4℃100000r/m in离心1h，将蛋白沉淀用50mM pH7.5Tris-Cl重悬沉淀后4℃，100000r/m in离心1h，弃上清，用裂解液Ⅰ(5M Urea、2M Thiourea、4%CHAPS、0.28%DTT)或裂解液 Ⅱ(5M Urea、2M Thiourea、2%CHAPS、2%SB3-10、l%DTT)溶解后分装，测定蛋白浓度，-70℃保存备用。

1.4 第一向等电聚焦(IEF) 分别用裂解液Ⅰ和裂解液Ⅱ溶解OMPs，采用pH3～107cm IPG胶条，上量样为140μg，IEF程序为Ⅰ；裂解液Ⅱ溶解OMPs，分别采用 pH3～10、pH4～713cm 的 IPG胶条，上样量为750μg，IEF程序为Ⅲ；裂解液Ⅱ溶解OMPs，pH4～713cm的IPG胶条，上样量分别 为 650μg、750μg、950μg，IEF 程 序 为 Ⅲ ；pH4～713cm的IPG胶条，裂解液Ⅱ溶解OMPs，上样量为75μg，IEF程序为Ⅲ。将蛋白样品采用水化液(7M Urea、2M Thiourea、4%CHAPS、0.4%DTT、0.5%IPG buffer、痕量溴酚蓝)补足至终体积125μL或250μL，主动水化12h后进行等电聚焦，7cm pH3～10聚焦程序Ⅰ为：300V，200Vhrs，1000V，300Vhrs，5000V，4000Vhrs，5000V，1250Vhrs，总电压时间积(Total)为 5751Vhrs；13cm聚焦程序Ⅱ为：300V，1h，500V，2h，1000V，1h，8000V，2∶30h，8000V，0∶55h，Total为 20000Vhrs；或聚焦程序Ⅲ 500V，2h，1000V，1h，8000V，2∶30h，8000V，4h，Total为41000Vhrs。聚焦结束后，取出胶条，-70℃保存或直接进行平衡。

1.5 第二向SDS-PAGE电泳 聚焦电泳后的IPG胶条在平衡缓冲液Ⅰ(6M Urea，75mM pH8.8Tris-HCl、29.3%甘油、2%SDS、0.002%溴酚蓝、1%DTT)中于摇床上振荡平衡15m in，然后在平衡缓冲液Ⅱ(6M Urea、75mM pH8.8Tris-HCl、29.3%甘油、2%SDS、0.002%溴酚蓝、1%DTT、2.5%IAA)中再平衡15min。第二向SDS-PAGE电泳在mini VE或SE600Ruby垂直电泳仪上进行，电泳结束后，胶体考马斯亮蓝[7]或PlusOne银染试剂盒染色。

1.6 凝胶图像的扫描 使用Imagescanner扫描仪和Labscan扫描软件以及Imagemaster 2D Platinum 7.0凝胶分析软件对凝胶进行扫描成像并分析，分辨率设置为600ppi。

2 结 果

2.12 -DE条件优化

2.1.1不同裂解液对蛋白质2-DE图谱的影响采用7cm pH3～10IPG胶条，上量样为 140μg，IEF程序为Ⅰ，考马斯亮蓝染色，分别用裂解液Ⅰ和裂解液Ⅱ溶解OMPs，2-DE图谱见图1。虽然两者的蛋白上样量均不足，但含SB3-10的裂解液获得的蛋白点较多。

2.1.2不同pH范围对蛋白质2-DE图谱的影响裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，上样量为750μg，IEF程序为Ⅲ，考马斯亮蓝染色，分别用13cm pH3～10、pH4～7IPG胶条，2-DE图谱见图2。蛋白点主要集中在pH4～7的范围内，而且酸性端蛋白较集中，为了获得更好的分离率，采用pH4～7IPG胶条进行电泳。

图1 不同裂解液溶解OMPs对双向电泳图谱的影响Fig.1The effect of different lysis buffer to 2-DE profile of OMPs

图2 不同pH范围对双向电泳图谱的影响Fig.2The effect of different pH range to 2-DE profile of OMPs

2.1.3不同聚焦时间对蛋白质2-DE图谱的影响裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，采用13cm pH4～7IPG胶条，上样量为750μg，IEF程序为Ⅱ或Ⅲ，考马斯亮蓝染色，2-DE图谱显示，总聚焦功率由程序Ⅱ200000VHrs增加至程序Ⅲ410000VHrs时，蛋白质充分聚焦，凝胶图上的蛋白质点呈圆点，无横向拖尾(图 3)。

2.1.4不同上样量对蛋白质2-DE图谱的影响裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，采用13cm pH4～7IPG胶条，IEF程序为Ⅲ，考马斯亮蓝染色，上量样分别为650μg、750μg、950μg。图像经软件分析显示，650μg上样量有154个蛋白点(图4A)，750μg蛋白上样量有196个蛋白点(图3B)，950μg上样量有163个蛋白点(图4B)。

2.1.5不同染色方法对蛋白质2-DE图谱的影响裂解液Ⅱ溶解Bb的OMPs，采用13cm pH4～7IPG胶条，上量样为75μg，IEF程序为Ⅲ，银染结果显示能够获得更多的低丰度蛋白点(图5)。

图3 不同聚焦时间对双向电泳图谱的影响Fig.3The effect of different IEF condition to 2-DE profile of OMPs

图4 不同上样量对双向电泳图谱的影响Fig.4The effect of different sample loading to 2-DE profile of OMPs

图5 银染获得的双向电泳图谱Fig.5The 2-DE profile of OMPs stained w ith silver

2.1.6样品的稳定性按照优化的2-DE条件，分别在第1d、第14d及60d进行电泳，图像经Imagemaster 2D Platinum 7.0分析软件分析，显示该样品蛋白点有所减少，第1d时蛋白点为196个，第14d蛋白点189个，第60d时蛋白点为146个，表明应尽量采用新鲜制备的蛋白样品，才能使样品更真实地反应细菌本身蛋白表达情况。

2.22 -DE图谱 最终我们确定了采用碳酸钠法提取Bb的OMPs，裂解液Ⅰ溶解蛋白样品，pH4～7的13cm线性胶条考染上样量为750μg，银染量为75μg，主动水化方式、聚焦总电压时间积为41000Vhrs时能够得到聚焦良好、分离清晰的Bb的OMPs图谱。并能够获得比较多的蛋白斑点(190±5)个(图 5)；2-DE图谱显示，Bb的OMsP等电点分布范围约在pI 4～7之间，蛋白斑点大部分在偏弱酸性区域(pH4.5～6)；蛋白质的分子量分布范围基本在从10ku～100ku之间，主要集中在30ku～75ku之间。

3 讨 论

2-DE的关键在于蛋白样品的制备，因此蛋白质提取方法为影响2-DE结果的重要因素。OMPs的提取方法很多，常用的有等密度梯度离心法[8]，Sarkosyl法[9]、Wooldridge 法[10]、碳酸钠法[11]等。这几种方法中，等密度梯度离心耗时较长，Sarkosyl法所需试剂昂贵，Wooldridge法提取蛋白，经两次离心后，蛋白沉淀很难溶解；商品化的试剂盒操作简便，体积小，节约时间，但获得的样品量少，需要多次制备样品，提取的蛋白含有一定疏水结构域的胞质蛋白质。经过比较，本研究选择了碳酸钠法提取OMPs，其原理是，OMPs在碱性的碳酸钠环境中，由闭合的微囊泡结构转变为开放的片层结构，同时剥离松散连接的外周蛋白[4]，该方法重复性好，能保留完整的OMPs，其提取的OMPs比例较高。

OMPs是革兰氏阴性细菌的特有成分，含有丰富的疏水性结构，水溶性差，含量低，不利于OMPs的2-DE分离。Molloy等研究显示，采用不同的裂解液对E.coli蛋白进行分级提取获得2-DE图谱与一步法用5M Urea、2M Thiourea、2%(W/V)CHAPS、2%(W/V)SB3～10裂解液溶解获取的图谱进行匹配，能够获得与分级提取基本相同的蛋白[4]。通过比较，本研究最终选择采用该裂解液溶解OMPs，溶解效果良好。

上样量的大小与胶条长度、pH范围及染色方法等有关，是影响2-DE图谱效果的另一重要因素。上样量低，易造成蛋白斑点模糊不清或无法显示；上样量提高利于低丰度蛋白的检测，但高丰度蛋白斑点过大，会影响其他蛋白质点的分离；染色方法的灵敏度高，所需蛋白上样量可适当减少。通过比较，我们最终选择13cm pH4～7IPG胶条的上样量为750μg，银染上样量为75μg，获得了蛋白点清晰聚集良好的蛋白图谱。

本研究首次应用2-DE技术分离Bb的OMPs，通过对裂解液、上样量、聚焦条件等进行优化，建立了分辨率高、重复性好的Bb OMPs的2-DE图谱，为进一步研究Bb的OMPs免疫蛋白质组学提供了技术保障。

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