基于“方证相应”理论验证慢性间歇性缺氧模型气阴两虚证候属性的初步研究*

王文萍，柴程芝，寇俊萍，朱丹妮，严永清，余伯阳

（中国药科大学中药复方研究室，南京 211198）

气阴两虚证是临床常见证型，可见于多种急性热病后期与各种慢性内伤杂病之中［1］，以形体消瘦、食欲不振、体倦乏力、烦躁、心悸、脉细数等表现为主要临床特征［2］。到目前为止，尚缺乏成熟的可供临床及药理学研究的理想的气阴两虚证动物模型［3］。本课题组在前期研究中发现，不同缺氧方式均能够诱导慢性间歇性缺氧小鼠表现为：体重下降，摄食量减少、自发活动改变、心率加快、T波持续性升高等心电图异常改变以及断尾出血时间缩短，不仅验证了采用慢性间歇性缺氧为手段构建气阴两虚证动物模型的可行性，而且体现了由虚到瘀的病机演变过程，符合气阴两虚证的临床病机演变规律［4、5］。本研究依据“方证相应”理论，拟采用益气养阴的代表方生脉散干预，考察其对慢性间歇性缺氧模型模拟气阴两虚证的各项指标的改善程度，从“以方测证”的角度进一步验证模型的气阴两虚证候属性，考察模型与气阴两虚证的相关性。

1 材料

1.1 药物及试剂

本研究所用的红参、麦冬、五味子饮片均购自南京传统中医门诊部，并由中国药科大学余伯阳教授鉴定，符合《中华人民共和国药典》标准；钠石灰由上海陆都化学试剂厂生产（批号20090120）。

1.2 药物制备

将红参、麦冬、五味子 3味药剪碎，按照 1∶3∶1.5比例混匀后，用单蒸水浸泡30min，分别加10倍、8倍、6倍单蒸水分别煎煮 60min后过滤，将滤液合并，水浴浓缩至浓度为0.55g/ml备用。

1.3 动物

ICR小鼠雄性，体重 18 g ～22 g，SPF级，由扬州大学比较医学动物中心提供（动物合格证号SCXK（苏）2007-0001）。

1.4 仪器

低压氧全自动控制仪（简称低压氧仪，南京新飞分析仪器制造有限公司，型号 XF-YC06）；心电图机（日本光电工业株式会社，型号 EGG-6511）。

2 方法

2.1 造模方法 30只小鼠随机分为空白对照组、模型组和生脉散组，每组10只饲养于同一笼内，每笼小鼠每天给定量食物100 g，自由饮水。空白组每天正常喂养，早晨灌服生理盐水0.2ml/10g；模型组每晚9点开始禁食，次晨8点放入低压氧仪缺氧箱中，将氧分压调至 7％ ～8％，持续缺氧 20min，每天1次，连续42 d；生脉散组在每天缺氧前30min灌服生脉散水提液0.2ml/10g体重，其余处理与模型组相同。

2.2 观测指标

2.2.1 体重 分别于实验第 1、7、14、21、28、35、42天早晨9时供给食物前，分别称体重并作记录。

2.2.2 摄食量 分别于实验第 1、7、14、21、28、35、42天晚间 9时禁食前称剩余食物量并作记录。

2.2.3 自发活动 分别于实验第 1、7、14、21、28、35、42天上午9时，采用新型开场系统考察各组的自发活动［6］，包括：①运动力，即行走格数：观察2min内小鼠四肢所爬过的格子数；②直立数：观察2min内后肢站立，前肢离地1cm以上的次数。开场实验箱为直径30cm圆形场地，高20cm，有2个同心圆分为外侧、中间及中心区域，试验在暗室、安静的环境中进行。

2.2.4 心电图 于实验第 1、7、14、21、28、35、42天上午10时，用4％水合氯醛0.1ml/10g腹腔注射麻醉后30min测心电图，记录心率及 T波变化。

2.2.5 断尾出血时间 依据 Dejana等报道的方法［7］，于试验第43天上午 9时将小鼠固定，以毫米尺测量鼠尾长度并标记后以手术剪在尾端5 mm处剪断，之后将断尾立即浸入37℃的生理盐水中，记录出血时间。以出血停止60 s作为出血时间。

2.3 统计分析

实验结果均用 珋x±s表示。利用 SPSS 17.0软件的重复测量方差分析分析各组间体重、进食量、自发活动、心电图 T波、心率之间的差异。用单因素方差分析检验各组出血时间的差异，以 P＜0.05为统计显著性水平。

3 结果

3.1 各组间体重比较

图1显示，空白对照组体重呈逐渐增长趋势，模型组的体重增长缓慢，并且从第14天开始呈下降趋势，第21天到第42天与空白对照组比较均有极显著差异（P＜0.05）。与模型组相比较，生脉散组的体重一直呈增长趋势，与空白对照组保持一致，并且从第28天到第42天与模型组比较有极显著差异（P ＜0.01）。

3.2 各组间摄食量比较

图2显示了各组随着不同缺氧时程的进食量变化趋势。模型组小鼠的进食量在前2周明显下降，从第3周开始一直保持在较低水平，与空白对照组比较有极显著差异（P＜0.01）。生脉散组的摄食量在第1周有所下降，从第2周开始明显上升，与模型组相比较有极显著差异（P＜0.01）。

图1 生脉散对缺氧小鼠体重影响的经时变化

图2 生脉散对缺氧小鼠摄食量影响的经时变化

3.3 各组间自发活动比较

图3和图4分别显示了各组在不同时间的行走格数与直立次数。数据显示，模型组前2周的行走格数明显减少，随着缺氧时间的延长，从第14天开始逐渐增多并一直保持上升趋势；直立次数则一直呈逐渐上升的趋势，与空白对照组比较有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比较，生脉散组的行走格数与直立次数随着时间的延长基本处于稳定水平，与模型组比较有极显著差异（P＜0.01）。

图3 生脉散对缺氧小鼠行走格数影响的经时变化

3.4 各组间心电图比较

研究结果表明，与空白对照组相比较，模型组前4周的心率呈逐渐加快趋势（图5），T波随缺氧时间的延长一直呈逐渐抬高趋势（图6），与空白对照组比较有极显著差异（P＜0.01）。与模型组相比较，生脉散组的心率与T波基本平稳，在第14天、第28天与第28天、第42天与模型组相比有极显著差异（P ＜0.01）。

3.5 断尾出血时间

图4 生脉散对缺氧小鼠直立次数影响的经时变化

图5 生脉散对缺氧小鼠心率影响的经时变化

图6 生脉散对缺氧小鼠T波影响的经时变化

表1显示了空白对照组与模型组在实验第43天通过剪尾法测得的出血时间。与空白对照组比较，模型组的出血时间明显缩短，与空白对照组比较差异显著（P＜0.05）。与模型组比较，生脉散组的出血时间延长，但统计学无显著性差异（P＞0.05）。

4 讨论

辨证论治是中医学的诊疗特点与优势特色，“以方测证”是基于辨证论治的原则下，根据“有是证，用是方”的对应关系而提出的一种研究方法，该方法在上个世纪就被引入证候模型研究中并得到广泛应用［8～12］。本研究在慢性间歇性缺氧小鼠的表观行为特征能够部分模拟气阴两虚证主要临床特征的基础上，考察了益气养阴的代表方生脉散对模型干预后各项指标的变化，进一步从“以方测证”角度验证模型的证候属性。研究结果显示，生脉散能显著改善慢性间歇性缺氧诱导的小鼠体重，摄食量，自发活动，心电图等各项指标的异常改变，使小鼠体重及摄食量增加，自发活动和心率趋于稳定，T波随缺氧时间的延长无显著增高，断尾出血时间较模型组延长。在模拟气阴两虚证临床特征的各项指标中，对模拟食欲不振、体倦乏力、烦躁、心悸、脉细数的摄食量减少，行走格数减少、直立次数增加、心率加快、T波抬高等指标的改善尤其明显，与模型组比较有极显著差异。曲线下面积（AUC）也显示，生脉散干预组各项指标随时间变化趋势与空白对照组基本一致，二者比较无显著性差异［13］，初步证实了模型与生脉散主治气阴两虚证的相关性。

表1 生脉散对慢性间歇性缺氧小鼠断尾出血时间的影响

“以方测证”法虽然在某种程度上能够说明方所主治证与模型的相关性，但并不是验证模型证候属性的充分条件［14、15］。因此，关于慢性间歇性缺氧模型的气阴两虚证候属性验证，还需要通过其他气阴两虚证类方验证，不同方剂反证以及与表观行为指征相关的药效学指标验证等方法尚需进一步完善。

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