实时荧光定量PCR仪原理与技术关键点分析

郑沁春 福建省立医院设备科 （福州 350001）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种在体外模拟体内DNA复制的核酸扩增技术，以少量的DNA分子为模板，经过变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子[1]。由Mullis在1983年建立的PCR方法已成为分子生物学及其相关领域的经典实验方法[2]。能够提供PCR反应条件，自动完成PCR反应的仪器就叫做PCR仪[3]。近年来，该技术本身获得长足发展，可靠性不断提高，其中以实时荧光定量PCR技术的方法应用最为广泛，已成为分子生物学研究的基本技术平台，通过此技术平台开展的基因表达分析、基因检测、SNP（单核苷酸多态性）基因分型、基因突变扫描、染色体易位分析病毒载量分析、MicroRNA表达分析和CHIP等多种研究已取得了众多成果，得到了国际相关领域专业人士的认可[4]。

1.实时荧光定量PCR原理

图1. Ct值与起始模板浓度的关系

所谓实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[5]。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成3个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。……