NF-κB和AP-1在胶原性关节炎小鼠滑膜组织中的表达及活性升高

罗心静，莫选荣，周玲玲

(台州学院医学院生理学教研室，浙江台州318000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以累及周围关节为主要表现的系统性自身免疫病。炎性细胞因子过度表达是导致RA滑膜炎症和骨质破坏的重要因素。而在炎性介质的表达调节中，核转录因子Kappa B(nuclear factor κB，NF-κB)和激活蛋白 1(activator protein-1，AP-1)被认为是最重要的转录调控分子，它们的表达和活性增加可促进炎性细胞因子的生成［1－2］。本研究观察了胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠滑膜中 NF-κB 和 AP-1表达及活性变化，以探讨RA病变的机制。

1 材料与方法

1.1 动物:清洁级雄性DBA/1小鼠20只，年龄8～10周(上海实验动物中心)，正常饲养。

1.2 试剂:牛II型胶原(Chondrex公司);完全福氏佐剂(CFA)或不完全福氏佐剂(FIA)(Sigma公司);TNF-α和IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(博士德公司);抗AP-1(fos)抗体和抗NF-κB(P65)抗体(Cell signal公司);电泳迁移率分析(EMSA)试剂盒(Pierce公司);AP-1寡核苷酸探针(5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3')、NF-κB 寡核苷酸探针(5'-AGTTGA GGGGACTTTCCCAGGC-3')由上海英俊公司合成。

1.3 分组和造模:将小鼠随机分成正常对照组和CIA模型实验组。CIA模型制备参照文献［3］。初次免疫30 d后处死小鼠，心脏取血，分离血清，并取左后足跖趾关节连续冰冻切片。

1.4 细胞因子检测:小鼠血清中 TNF-α、IL-6的含量用ELISA法检测，具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。

1.5 免疫组化法检测NF-κB和AP-1表达:石蜡切片脱蜡水化;蒸馏水冲洗后于3%H2O2孵育10 min，PBS洗后微波法修复抗原，滴加封闭血清，室温孵育20 min;滴加适当稀释抗NF-KB(P65)或抗AP-1(fos)抗体，37℃孵育2 h;PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗，37℃孵育15 min;PBS冲洗后滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min;PBS冲洗后滴加DBA显色。冲洗后苏木素复染，中性树胶封片。图片分析仪进行图片分析，测定平均吸光度值。……