金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰小鼠细胞膜转运能力的影响

田嘉铭 杨国栋 饶 娜 安 芳 王书华 (河北北方学院，河北 张家口 075000)

金莲花是毛茛科植物金莲花的干燥花及花蕾，有清热解毒，消肿明目的功效，临床上主要用于上呼吸道感染、扁桃体炎〔1〕等。金莲花中主要药效成分是荭草苷和牡荆苷，具有抗氧化、抗肿瘤〔2，3〕、降压等作用，金莲花药材和其制剂多以测定牡荆苷和荭草苷的含量控制其质量〔4〕。药代动力学对金莲花有效成分单体荭草苷与牡荆苷研究指出，在动物体内吸收快，分布也快，药物起效迅速，主要以消除为主，广泛分布于动物体内的各组织，肾脏中浓度最高〔5，6〕。通过本实验室对金莲花有效成分单体荭草苷与牡荆苷的药代动力学研究以及药理学研究表明，金莲花有效成分单体荭草苷与牡荆苷具有良好的抗氧化作用〔7〕药物入肾，提高机体细胞膜的转运能力，提供了一个有力的证据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 荭草苷和牡荆苷(河北北方学院实验中心，经1H-NMR和 HPLC鉴定纯度 98.9%);D-半乳糖;分析纯;Na+-K+-ATP酶测试盒，南京建成生物有限公司(批号:20100920);Ca2+-Mg2-ATP酶测试盒，南京建成生物有限公司(批号:20100920)考马斯亮蓝蛋白试剂盒，南京建成生物有限公司(批号:20100918)。

1.2 动物 昆明种小鼠(河北北方学院动物中心提供)。

1.3 仪器 U-3900紫外可见分光光度计(日本);ME235S十万分之一电子天平(日本);DK-8型电热恒温水槽(上海精密实验设备有限公司);低温高速离心机(赛多利斯公司);HQ-60型旋涡混合器(北方同正生物技术发展公司)。

1.4 造模方法 采用D-半乳糖致亚急性衰老法，将D-半乳糖10 000mg溶于500ml生理盐水中，按注射剂量200 mg·kg-1·d-1(即每克体重0.01 ml)给小鼠腹腔注射，正常对照组注射等体积生理盐水，造模时间为8 w，每天称重一次，依据末次称重的克数调整给药剂量。

1.5 模型验证 造模第6周和第8周分别选取正常组和造模组大鼠(备用)8只，摘眼球采血，分离血清，测定总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，以验证小鼠衰老情况。第8周末，造模组小鼠指标与正常组相比具有统计学意义，显示模型复制成功。

1.6 给药方法 荭草苷和牡荆苷溶液的配制:荭草苷和牡荆苷先用N，N-二甲基甲酰胺溶解后，再加吐温-80助溶，轻轻振荡使混匀，然后再加入生理盐水(N，N-二甲基甲酰胺∶吐温-80∶生理盐水=1∶1∶20)。各治疗组从第9周始每日上午分别灌胃给药，正常对照组和模型对照组给等体积的生理盐水。根据实验小鼠与人的体表面积比例系数换算，维生素E组确定给药剂量是20 mg/kg，荭草苷、牡荆苷高剂量组40 mg/kg，荭草苷、牡荆苷中剂量组20 mg/kg，荭草苷、牡荆苷低剂量组10 mg/kg，每天称重一次，依据小鼠末次体重调整给药剂量。给药时间8 w。

1.7 细胞膜转运能力的测定

1.7.1 Na+-K+-ATP酶活性的测定 准确称取小鼠肝、脑、肾组织重量，按10%重量体积比制成组织匀浆液，再取一定量的匀浆液加99倍的生理盐水制成0.1%的组织匀浆液0.1 ml，同时用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白。根据公式计算酶的活性:Na+-K+-ATP酶(U/mgprot)=(测定管吸光度值-对照管吸光度值)/(标准管吸光度值-空白管吸光度值)×(标准管浓度×稀释倍数)/匀浆蛋白的含量。

1.7.2 Ca2+-Mg2-ATP酶活性的测定 准确称取小鼠肝组织重量，按重量体积比制成10%的匀浆液，再取一定量的匀浆液加99倍的生理盐水制成0.1%的组织匀浆认0.1 ml同时用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白，按公式计算其活性。Ca2+-Mg2+-ATP酶(U/mgprot)=(测定管吸光度值-对照管吸光度值)/(标准管吸光度值-空白管吸光度值)×(标准管浓度×稀释倍数)/匀浆蛋白的含量。

1.8 统计学方法 实验数据采用SPSS16.0统计软件进行处理，结果用±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰小鼠体内Na+-K+-ATP酶活性能力的影响 与模型对照组相比，空白组组织内Na+-K+-ATP酶的活性明显高于模型组(P＜0.01);荭草苷和牡荆苷各治疗组的含量明显升高，与之相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，说明小鼠衰老后细胞膜的Na+-K+-ATP酶活性明显降低，而各治疗组均具有升高其含量的作用，见表1。莲花中荭草苷和牡荆苷中、低剂量组对组织细胞膜Na+-K+-ATP酶的影响作用低于维生素E组，与维生素E组相比，荭草苷和牡荆苷中、低剂量组具有显著性差异(P＜0.05);红草苷高剂量组与维生素E组相比无显著性差异。在对组织上Na+-K+-ATP酶的活性影响上，金莲花中荭草苷中、低剂量组作用明显高于牡荆苷同等的剂量组。荭草苷中、低剂量组分别与牡荆苷中、低剂量组相比较，具有显著性差异(P＜0.05)，荭草苷和牡荆苷高剂量组相比无显著性差异。

表1 各组不同组织Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性能力(±s，U，n=8)

表1 各组不同组织Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性能力(±s，U，n=8)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与维生素E组比较:3)P＜0.05;与荭草苷中剂量组比较:4)P＜0.05;与荭草苷低剂量组比较:5)P＜0.05

组别 Na+-K+-ATP肝肾脑Ca2+-Mg2+-ATP肝肾脑±0.624 9.832±0.855 11.254±0.793模型组 2.316±0.776 4.891±0.535 5.027±0.961 2.616±0.798 5.891±0.935 6.027±0.861维生素E组 4.124±0.6312) 7.963±0.9722) 9.124±0.5402) 4.124±1.0312) 7.963±0.9721) 10.124±0.9402)荭草苷高剂量组 4.059±0.5271) 7.864±1.3042) 8.659±0.6042) 4.129±1.0122) 7.864±1.3041) 8.659±1.2042)3)荭草苷中剂量组 3.976±0.3232) 7.656±0.5142) 8.427±0.7692) 3.804±0.8231) 7.723±1.0142) 8.427±0.7692荭草苷低剂量组 3.425±0.6691)3) 6.395±0.4321)3) 7.238±0.6341)3) 3.320±0.8692)3) 6.792±1.0052) 7.238±0.934牡荆苷高剂量组 3.613±0.8242) 7.723±0.6672) 8.0214±0.4772) 3.801±0.6242) 7.523±0.8672) 8.596±0.8772)牡荆苷中剂量组 3.091±0.4242)3)4)7.604±0.5862)3)4)7.812±0.5871)3)4)3.491±0.4341)3)4)7.004±0.9862)3)4)8.342±0.9871)3)4)牡荆苷低剂量组 2.865±1.3201)3)5)6.124±0.6951)3)5)6.806±0.7321)3)5)3.004±0.6201)3)5)6.217±0.8951)3)5)7.094±1.8901)3)5)空白组 4.528±0.624 9.236±0.455 10.254±0.793 5.128

2.2 金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰小鼠体内Ca2+-Mg2-ATP酶活性能力的影响 金莲花中荭草苷和牡荆苷都具有提高肝、脑、肾组织细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，与模型组相比，空白组组织内Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01);各治疗组的含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，说明小鼠衰老后细胞膜的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显降低，而各治疗组均具有升高其含量的作用，见表1。

金莲花、荭草苷和牡荆苷中、低剂量组对组织细胞上的Ca2+-Mg2+-ATP酶的影响作用低于维生素E组;与维生素E组相比，荭草苷和牡荆苷中、低剂量组具有显著性差异(P＜0.05)，荭草苷和牡荆苷高剂量组与维生素E组相比，无显著性差异。对组织上Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性影响上荭草苷中、低剂量组作用明显高于牡荆苷中、低剂量组，荭草苷中、低剂量组分别与牡荆苷中、低剂量组相比较，具有显著性差异(P＜0.05)，荭草苷与牡荆苷高剂量组相比无显著性差异。

3 讨论

衰老过程中常伴有Ca2+自然平衡失调，引起细胞内钙离子的超载，并有可能是神经系统的老化动因之一。最近的研究发现，细胞内Ca2+的超载与衰老的老年性疾病密切相关，而Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性是Ca2+分布的基础，现已作为观察衰老的新指标〔8〕。Na+-K+-ATP酶导致细胞内ATP的生成和钠离子转运障碍，从而影响细胞的整体功能。Ca2+-Mg2+-ATP酶可以水解ATP，使细胞内Ca2+转运到细胞外，以维持细胞内相对较低的Ca2+浓度，这是维持细胞稳态的重要机制之一，也是细胞得以正常发挥功能的基础。研究表明，自由基的损伤对细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶有抑制作用，自由基可直接氧化ATP酶蛋白氨基酸残基，使酶失活，ATP酶活性降低可影响神经元细胞内Ca2+的分布，导致细胞内Ca2+的浓度大增，神经细胞内Ca2+水平的升高可使细胞骨架和膜结构的不稳定，可激活Ca2+依赖性降解酶，内切酶磷脂酶使膜磷脂水解，花生四烯酸释放增加，同时又产生大量自由基，使膜通透性增大，造成恶性循环细胞衰老，是生物体整体衰老的基础。

本试验发现，而金莲花中有效成分单体中荭草苷与牡荆苷各治疗组均具有较好的提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性作用，减少自由基对细胞膜的损伤，维持细胞膜的稳定性和Ca2+的稳态，从而发挥抗衰老作用。金莲花中有效成分单体中荭草苷中、低剂量组对于提高组织细胞膜上的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性高于牡荆苷同等剂量组，表明荭草苷在提高机体内活性比牡荆苷的具有较强的作用。

1 李药兰，叶绍明，王凌云，等.长瓣金莲花中原金莲酸的分离和生物活性〔J〕.暨南大学学报(自然科学版)，2002;23(1):124-6.

2 孙 黎，程建贞，罗 强，等.金莲花黄酮对 K562、HeLa、Ec-109、NCI-H446细胞增殖的影响〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2009;44(5):981-3.

3 孙 黎，刘 芳，刘 华，等.金莲花黄酮对人乳腺癌细胞作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(9):1098.

4 黄文哲，王 磊，段金廒.短瓣金莲花化学成分的研究〔J〕.中草药，2001;31(10):731-2.

5 曲彩红.金莲花中荭草苷兔体内药代动力学研究〔D〕.中国优秀硕士学位论文全文数据库，2010.

6 颜 娟.金莲花中牡荆苷兔体内药代动力学研究〔D〕.中国优秀硕士学位论文全文数据库，2010.

7 颜 娟，胡海娜，曲彩红，等.金莲花总黄酮抗氧化作用的研究〔J〕.时珍国医国药，2010;21(2):386.

8 张 伟，张艳淑，姚 林，等.Oncolyn对衰老小鼠脑组织中ATP酶活性和神经生长因子的表达的影响〔J〕.卫生研究，2007;36(2):164-6.