冷水胁迫下水稻分蘖期耐冷性状QTL定位研究

邹德堂，李 姣，郑洪亮，刘化龙，王敬国

（东北农业大学水稻研究所，哈尔滨 150030）

水稻对低温反应较敏感，低温引起水稻减产在世界高纬度和高海拔地区普遍发生，在中国东北和西南高海拔地区尤为突出。水稻在萌芽期、芽期、幼苗期、分蘖期、孕穗期、开花期和成熟期等生长发育时期都会发生不同程度的低温冷害。在水稻生长早期，籼稻18℃以下、粳稻15℃以下，其生长就会受到不同程度的抑制。如幼苗期和分蘖期常遇到低温胁迫，影响水稻早期的生长发育[1-2]。因此，水稻生长早期的耐冷性应引起研究人员的重视。分蘖期是水稻生长发育的一个重要时期，近年来，对水稻生长早期耐冷性研究多局限于萌芽期、芽期、幼苗前期，且大部分研究都处于探索阶段。以粳粳杂交研究分蘖期耐冷性QTL定位报道还较少。因此需要从东北地区已有的粳稻群体中尽可能多地鉴定出有利的等位基因，对其进行表型效应的遗传估算，对低温处理条件下材料的敏感性进行评价，最终将克隆出的耐冷性有利基因聚合在一起，成功培育出东北地区耐冷优良品种。本试验采用微卫星标记手段，对水稻生长早期耐冷性进行QTL定位研究，旨在找出影响水稻生长早期耐冷性状的基因位点，为今后水稻生长早期耐冷基因的精细定位和分子标记辅助育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 作图群体构建

本试验以黑龙江地区高产优质水稻品种东农422和耐冷性强的水稻品种空育131作为杂交亲本，双亲杂交所衍生的F2:3群体共180个株系作为研究对象。东农422由东北农业大学培育并提供，空育131原产于日本，由黑龙江省农垦科学院水稻研究所从吉林省农科院引进并选育而成。

1.2 水稻分蘖期耐冷性鉴定

2011年在东北农业大学香坊实验实习基地进行。随机区组设计，单行区，每行种植20株。常规栽培管理同一般田间生产。从插秧后25 d开始，用17℃冷水处理至成熟期，水深保持5 cm。在分蘖期调查苗高、分蘖数和叶绿素含量，并计算地上部生长量和冷水反应指数。冷水反应指数（CRI，%）＝（冷水处理区性状表型值/自然区性状表型值）×100%[3]。与处理组相应的对照组不灌溉冷水，采用大田常规栽培管理。

1.3 DNA提取和SSR检测

分蘖盛期在每一家系内随机选取5株新鲜叶片，放置于-80℃超低温冰箱中保存。以CTAB法提取家系及亲本总DNA[4]，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳40 min，通过凝胶成像仪观察并统计DNA浓度，ddH2O进行DNA稀释。PCR反应总体积为10 μL，体系包括3 μL的模板DNA（25 ng·μL-1），1 μL 10×PCR缓冲液，0.75 μL MgCl2（25 mmol·L-1），1 μL SSR引 物（12 ng·μL-1），0.15 μLdNTP（10 mmol·L-1），0.1 μL Taq酶（5U·μL-1），ddH2O补足至10 μL，最后加入液体石蜡覆盖体系。PCR扩增步骤包括94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃延伸1 min，4℃保存。扩增结果采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法检测。

1.4 遗传连锁图谱的绘制和QTL分析

优先选用相关文献中多态性好的引物以及Gramene网站中公布的引物数据，选择均匀分布于水稻12条染色体上的600对SSR标记，由上海生工生物工程有限公司进行序列合成。经过两个亲本东农422和空育131的多态性检验，从中筛选出与两个亲本间有差异的引物，并利用筛选出有多态性的引物对F2代180个群体的DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行统计。应用软件QTL IciMapping 3.1构建分子标记连锁图谱，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距（cM），利用Mapchart 2.1进行遗传连锁图谱的绘制。

利用QTL IciMapping 3.1的完备区间作图法（ICIM）进行QTL定位，取LOD＝2.5为QTL的阈值。QTL的命名原则遵循McCouch等提出的方法[5]。按照Stuber等方法[6]，根据显性度（Dominant degree，DR）即显性效应与加性效应的绝对值比值判断每个QTL的基因作用方式。当DR≤0.2时，基因效应为加性；当0.2＜DR≤0.8时，基因效应为部分显性；当0.8＜DR≤1.2时，基因效应为显性；当DR＞1.2时，基因效应为超显性。加性效应为正值表示增效等位基因来源于高值亲本，为负值表示来源于低值亲本。

2 结果与分析

2.1 作图群体分蘖期耐冷性鉴定

在冷水胁迫和自然灌溉条件下，亲本及F3家系群的苗高、分蘖数、地上部生长量、叶绿素含量及它们的冷水反应指数的变异范围、变异系数和平均值列于表1。从冷水反应指数来看，分蘖期经过人工冷水胁迫后，东农422相关指标的冷水反应指数均低于空育131的各冷水反应指数，说明东农422的耐冷性比空育131弱。F3家系在苗高、分蘖数、地上部生长量和叶绿素含量等性状经冷水处理后相应的平均值明显低于自然灌溉条件，冷水处理对水稻分蘖期生长影响较大。从变异系数来看，冷水处理条件下各性状的变异系数均高于自然条件下相应性状的变异系数，说明F3株系的各性状对冷水的反应存在较大差异。从变异范围来看，冷水胁迫后的相应指标与自然对照相比明显较低，说明分蘖期冷水胁迫使水稻生长受到抑制，各性状表型值间均有不同程度下降。

表1 冷水处理条件和自然条件下亲本及F3家系相关性状的表型分析Table1 Phenotypic analysis of related traits with F3lines and parents at tillering stage under cold water irrigation and natural condition

从表1中可以看出，在冷水胁迫条件下，分蘖期F3家系在苗高、分蘖数、地上部生长量、叶绿素含量及其相应的冷水反应指数的平均值都介于亲本之间。通过对数据处理发现，这些性状的偏度、峰度绝对值均小于1，说明这些相关性状符合正态分布。推断上述性状是由主基因和多基因共同控制的数量性状，适合进行QTL定位。

2.2 水稻分蘖期耐冷相关性状的QTL定位

以75个SSR标记构建水稻遗传连锁图，利用QTL IciMapping 3.1软件在分蘖期冷水处理条件下对水稻苗高、分蘖数、地上部生长量和叶绿素含量及其冷水反应指数进行QTL分析（列于表2）。共检测到与分蘖期耐冷相关性状相关的QTL 21个（见图 1）。分布在第 2、3、5、6、7、8 和 12 染色体上，LOD值在2.50～6.69之间，贡献率变幅为2.6%～52.2%。基因作用方式表现为加性、显性、部分显性或超显性。其增效等位基因除大部分来自冷敏亲本东农422，其余QTL均来源于耐冷亲本空育131。

2.2.1 苗高

冷水处理条件下检测到与苗高相关的QTL有3个，分别位于第7、8和12染色体上。其LOD值变异范围为2.50～3.86，贡献率变异范围为6.9%～11.2%。其中位于第12染色体RM1302-RM415区间qSH-12对表型变异解释率较大，为11.2%，是主效QTL。除qSH-12增效等位基因来自东农422，其余QTL的增效等位基因来自于空育131。这些QTL增效等位基因主要表现为加性。冷水灌溉条件下检测到与苗高冷水反应指数的QTL有1个，位于第3染色体上。其LOD值为2.55，对表型变异解释率为2.6%，其解释率较小。qSHCRI-3的增效等位基因来自于东农422，基因作用方式表现为加性。

2.2.2 分蘖数

冷水条件下检测到与分蘖数相关的QTL有3个，均位于第3染色体上。其LOD值范围为2.98～3.99，位于第3染色体的RM251-RM1284区间的qNT-3-1对表型变异解释率为52.2%，位于RM251-RM1284区间的qNT-3-2对表型变异解释率为46.6%，很明显这两个QTL是主效QTL，且置信区间距离为28.17 cM（见图1）。它们的增效等位基因均来自于空育131，基因作用方式表现为加性。

表2 分蘖期耐冷相关性状QTL分析Table2 QTL analysis of related traits at tillering stage under cold water condition

冷水条件下检测到与分蘖数冷水反应指数相关的QTL有4个，分别位于第2、3染色体上。其LOD值范围为2.78～6.42，位于第3染色体的RM251-RM1284区间的qNTCRI-3-1、qNTCRI-3-2和qNTCRI-3-3对表型变异解释率分别为45.6%、46.0%和43.6%，置信区间为28.17 cM，为主效QTL。而位于第2染色体的RM550-RM341区间的qNTCRI-2对表型变异解释率为9.0%，贡献率比较小。这4个QTL的增效等位基因均来自东农422，基因作用方式为加性。

2.2.3 地上部生长量

冷水条件下检测到与地上部生长量相关的QTL有2个，分别位于第3和6染色体上。其LOD值分别为3.87和2.74，其中位于第3染色体RM251-RM1284区间的qAGB-3和位于第6染色体的RM1340-RM1370区间的qAGB-6对表型变异解释率分别为50.8%和25.0%，是两个主效QTL，其中qAGB-6的置信区间在50.0 cM以上（见图1），还要进行精确的定位以找到准确的QTL位点。这2个QTL增效等位基因都来源于空育131，基因作用方式表现为加性。

冷水条件下检测到与地上部生长量冷水反应指数相关的QTL有2个，分别位于第3、6染色体上。其LOD值分别为3.10和2.58，其中位于第3染色体RM251-RM1284区间qAGBCRI-3的表型变异解释率为43.7%，是主效QTL，置信区间为28.17 cM，还有待于进一步验证（见图1）。而位于第6染色体的RM340-RM494区间qAGBCRI-6的表型变异解释率为4.0%，它的贡献率较小。qAGBCRI-3增效等位基因来自东农422，qAGBCRI-6增效等位基因来自空育131。基因作用方式表现为加性。

图1 冷水胁迫下水稻分蘖期相关性状及其冷水反应指数的QTL区间分布Fig.1 QTL interval mapping of related traits and their cold response index at tillering stage under cold water stress in rice

2.2.4 叶绿素含量

冷水条件下共检测到与叶绿素含量相关的QTL有4个，分别位于第2、5、7和12染色体上。其LOD值变异范围为2.70～6.69，对表型变异解释率为6.1%～17.1%。其中位于第7染色体RM1306-RM1357区间qCC-7对表型变异解释率为17.1%，是主效QTL，置信区间为10.2 cM。是一个比较准确的QTL位点，可能在这个区间内存在一个有关耐冷条件下叶绿素含量的QTL位点，有待于在这方面寻找理论依据找出这个QTL位点。其他3个QTL对表型变异解释率均较小。

qCC-12增效等位基因来自空育131，其余3个QTL的增效等位基因均来自东农422。qCC-5和qCC-7增效等位基因表现为加性，qCC-2增效等位基因表现为部分显性，qCC-12增效等位基因表现为超显性。

冷水条件下检测到与叶绿素含量冷水反应指数相关的QTL有2个，位于第2、8染色体上。其LOD值分别为4.36和2.67，其中位于第2染色体RM207-RM208区间qCCCRI-2的解释率较大，为15.4%是主效QTL。而qCCCRI-8的贡献率比较小。qCCCRI-2和qCCCRI-8的增效等位基因都来自东农422。qCCCRI-2基因作用方式表现为显性，qCCCRI-8基因作用方式表现为加性。

3 讨 论

3.1 水稻分蘖期耐冷性分析

研究表明水稻耐冷性是一个复杂的遗传性状。水稻分蘖是决定产量的一个重要农艺性状，适当的分蘖数目直接决定水稻产量。水稻分蘖不仅是直接调控产量的一个关键农艺性状，同时也是在植物生物学中决定株型建成的一个核心问题。分蘖期是水稻对低温冷害影响较为敏感的一个时期。因此，研究分蘖期水稻相关性状耐冷性有着重要意义。前人对分蘖期耐冷性报道较少，大多集中在低温下幼苗生长活力、低温下发芽率等幼苗前期的报道。Jun等研究指出，低温发芽力主要由基因累加效应所控制，在F2代呈连续分布，其平均值偏向于低温发芽力较高的亲本，幼苗期耐冷性表现为以双亲中间值为中心或稍倾向于耐冷性强亲本的连续分布[7]。Li和Rutger指出，F1和F2代水稻幼苗长势在低温下呈显性和超显性[8]。本研究采用东农422/空育131群体组合，分蘖期经冷水灌溉之后，在苗高、分蘖数、地上部生长量和叶绿素含量方面东农422的冷水反应指数比空育131的冷水反应指数低，空育131的耐冷性要强于东农422。分蘖期冷水灌溉处理后性状与对照差异明显。F3家系经过分蘖期冷水胁迫后，冷水处理的变异范围要低于自然对照部分变异范围，而冷水胁迫后的变异系数明显高于对照组，其平均值偏向于耐冷性较强的亲本。

3.2 水稻分蘖期耐冷相关性状QTL定位

当前分子标记技术的发展为阐明QTL性状遗传基础提供强有力证据。迄今为止，对于水稻分蘖期耐冷相关性状QTL定位报道还较少。韩龙植等以叶赤枯度作为分蘖期耐冷性研究指标，利用籼粳交F2∶3代将有关叶赤枯度基因位点定位到第2、3、7、9、11染色体，贡献率在6.5%～7.9%范围内[9]。苗高是有关水稻生长发育的一个重要指标，有关水稻苗高、分蘖数QTL的研究已取得一定进展，前人研究过苗高分子标记的遗传分析，检测到12条染色体上的9条染色体有相关的QTL位点[10]。本试验中苗高QTL定位到第7、8、12染色体上，与前人定位结果大体相同。有研究学者认为水稻分蘖是一个复杂的发育性状，易受环境影响，对水稻产量形成影响较大，分蘖数目通常被认为是受数量性状位点控制。Wu等利用RFLP标记定位控制水稻数量性状的QTL时发现两个控制分蘖数目的QTLs分别位于第4和第12染色体上[11]。任翔等利用RIL群体对水稻分蘖能力进行QTL定位分析，在第2、5、8、9染色体上发现4个QTLs位点对分蘖能力有贡献，在第1、2染色体上成簇分布[12]。本研究通过微卫星标记进行分蘖数目基因定位，只在第3染色体上检测到影响分蘖数目QTLs，贡献率较小，很可能是由于微效基因控制的数量性状，也可能是不同材料控制各时期耐冷性的基因有差异，导致群体耐冷性遗传和生理特性产生差异，或不同处理条件导致基因调控网络有细微差异，使耐冷基因作用发生变化。

有关水稻叶绿素含量QTL定位的报道较少。崔克辉等利用RIL群体定位到2个控制剑叶叶绿素含量的QTL，贡献率仅为4.66%～6.67%[13]。汪斌等在第1、4、11染色体上检测到6个控制叶绿素a和b的QTL，贡献率为0.17%～10.71%[14]。在Ishimaru等构建的含有主要农艺性状和生理性状QTL的功能图谱中，有6个影响叶绿素含量的QTLs，分布于第1、3、5、8、12染色体上，贡献率为7.80%～10.80%[15]。通过以上数据比较可以发现，控制叶绿素含量的QTL贡献率大多在10%以下，说明叶绿素含量可能是由微效QTL控制。本研究中有关叶绿素含量QTL定位研究表明，在第2、5、7、12染色体上检测到影响分蘖期叶绿素含量的QTL位点，与前人研究结果不完全一致。其中位于第7染色体上的QTL置信区间较小（10.2 cM），对表型变异解释率（17.7%）较大，有可能是一个控制叶绿素含量的主效基因位点，为分蘖期叶绿素含量精细定位提供理论依据。

在前人研究中有关地上部生长量以及各性状CRI值QTL定位的报道尚少见。地上部生长量是通过苗高和分蘖共同作用体现出来的，是分蘖期水稻生长的一个重要指标，是分蘖期生长情况的综合体现。研究地上部生长量QTL定位有助于找到由苗高和分蘖合同协作的位点，为寒地粳稻研究开辟更加广阔的领域。本研究中影响地上部生长量QTL定位在第3、6染色体上，贡献率在25.05%以上，置信区间在28.17 cM，是主效QTL。在以后的研究中可以在这个染色体目标区段上进行精细定位研究，试图找到与地上部生长量相关的QTL位点，为今后寒地粳稻分蘖期耐冷性研究提供参考依据。冷水反应指数是低温处理下性状表型值与自然条件下性状表型值的相对比值，可以客观的评价性状在低温下受害程度。有关冷水反应指数研究报道较少，对于CRI定位还处于初步阶段。本研究中，分蘖数CRI值QTL定位和叶绿素含量CRI值的QTL贡献率较大，而苗高CRI值QTL和地上部生长量CRI值QTL贡献率较小。其基因作用方式表现为加性效应或显性效应。说明水稻耐冷相关性状CRI在杂交后代早期不易稳定，而在高世代才能稳定，故对其进行选择要在世代相对较稳定时进行。本试验研究冷水反应指数QTL定位，揭示胁迫处理与对照处理相互之间的关系，明确寒地粳稻耐冷性遗传基础，为今后寒地稻作冷害研究提供理论依据。

4 结论

本研究在冷水胁迫条件下，水稻分蘖期的苗高、分蘖数、地上部生长量和叶绿素含量及其冷水反应指数表现为近似正态的连续分布，认为是由主效基因和微效基因共同控制的数量性状。在第2、3、6、7、12染色体上有11个贡献率较大的QTL位点。其中，冷水胁迫下与苗高相关的QTL 3个；与苗高冷水反应指数相关的QTL 1个；与分蘖数相关的QTL 3个；与分蘖数冷水反应指数相关QTL 4个；与地上部生长量相关的QTL 2个；与地上部生长量冷水反应指数相关的QTL 2个；与叶绿素含量相关的QTL 4个；与叶绿素冷水反应指数相关的 QTL 2 个。其中 qSH-12、qNT-3-1、qNT-3-2、qNTCRI-3-1、qNTCRI-3-2、qNTCRI-3-3、qAGB-3、qAGB-6、qAGBCRI-3、qCC-7和qCCCRI-2对表型变异的解释率较大，分别为11.2%、52.2%、46.6%、45.6%、46.0%、43.6%、50.8%、25.0%、43.7%、17.7%和15.4%，为主效QTL。

[1]孙世臣,邹德堂,刘化龙,等.寒地水稻种质资源萌发期耐冷性鉴定评价[J].东北农业大学学报,2007,38(2):145-148.

[2]熊振民,闵绍楷,王国梁,等.早籼品种苗期耐冷性的遗传研究[J].中国水稻科学,1990,4(2):75-78.

[3]韩龙植,元东林,玄英实,等.水稻主要农艺性状的冷水反应遗传分析[J].中国水稻科学,2004,18(1):23-28.

[4]代翠红,李杰,朱延明,等.不同DNA提取方法对4种重要作物DNA提取效率的比较[J].东北农业大学学报,2005,36(3):329-332.

[5]Mc Couch S R,ChoY C,Yano M.Report on QTL nomenclature[J].Rice Gent Newl,1997,14(3):11-13.

[6]Stuber C W,Lincoln S E,Wolff D W,et al.Identification of genetic factors contributing to heterosis in a hybrid from two elite maize inbred lines using molecular markers[J].Genetics,1992,132(6):823-839.

[7]Jun B T,Kim J I,Cho S Y.Studies on the inheritance of quantitative charactersin rice.Ⅷ.Analysison the low temperature germination in diallel cross of F2generation[J].Korean J Breeding,1987,19:240-244.

[8]Li C C,Rutger J N.Inheritance of cool temperature seeding vigor in rice and its relationship with other agronomic characters[J].Crop Sci,1980,20:295-298.

[9]韩龙植,乔永利,曹桂兰,等.水稻生长早期耐冷性QTL分析[J].中国水稻科学,2005,19(2):122-126.

[10]Li C C.Diallel analysis of yield and its component traits in rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Breed Abstract,1977,47:45.

[11]Wu W R,Li W M,Tang D Z,et al.Time-related mapping of quantitative trait loci underlying tillering number in rice[J].Genetics,1999,151(5):297-303.

[12]任翔,翁清妹,祝莉莉,等.水稻分蘖能力QTL的定位[J].武汉大学学报:理学版,2003,49:533-537.

[13]崔克辉,彭少兵,邢永忠,等.水稻幼苗特性与籽粒大小关系的分子检测[J].植物学报,2002,44(6):702-707.

[14]汪斌,兰涛,吴为人,等.水稻叶绿素含量的QTL定位[J].遗传学报,2003,30(12):1127-1132.

[15]Ishimaru K,Yano M,Aoki N,et al.Toward the mapping of physiological and agronomic characters on a rice function map:QTL analysis and comparison between QTLs and expressed sequence tags[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,102:793-800.