肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究*

蒋玉凤 周德江 张建军 黄 飞 史小玲

转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）及其信号转导途径在肝纤维化发生机制中起着关键作用[1，2]。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF） 与金属蛋白酶组织抑制因 子 1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）都是TGF-β信号传导途径的下游信号介质[3，4]， 针对CTGF和 TIMP-1的小RNA干扰阻断TGF-β下游信号途径，将有望成为一种更特异和更有效的长期防治肝纤维化的手段。本研究旨在设计并构建同时含CTGF和TIMP-1靶基因片段的双重RNA干扰重组质粒，并转染到大鼠肝星状细胞，为进一步研究其对肝星状细胞细胞因子和细胞外基质分泌做准备。

材料与方法

一、材料 真核表达载体psiRNA-DUO-GFPzeo、感受态大肠杆菌Lyo Comp GT115、Fast-Medi aRZeoX-Gal、Fast-MediaRZeoX-GUS、lipofectamine（ 脂质体）2000试剂、Zeocin抗生素购自InvivoGen公司；限制性内切酶ACC 65I、Hind III、 BbsI、MakerO'RangeR μlerTM1000bpDNALadder、MakerO'RangeRμlerTM50bp DNA Ladder与T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；少量质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；胎牛血清购自天津TBD公司；目标OligoDNA由上海生工合成；大鼠肝HSC-T细胞株由我院中心实验室冻存。

二、CTGF和TIMP-1短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列的设计与合成 在线查询大鼠CTGF和TIMP-1基因序列，设计3个RNA干扰靶位，化学合成双链RNA（dsRNA），各自转染或不同组合转染经TGF-β1刺激活化的大鼠肝星状细胞。筛选出对Ⅲ型胶原、透明质酸、粘连蛋白抑制作用最强的RNA干扰候选靶位[5]（前期研究中已完成），即 CTGF：5’-GCCAGGAGAAAGACAGGUACU 和TIMP-1：5’-GCCUUCGUAAAGACCUAUAGU。 为便于克隆和鉴定，shRNA干扰序列的5'端和3'端分别引入ACC 65I和Hind III酶切位点，反义片段后接终止信号TTTTT以终止转录。形成ACC 65I+正义链+Loop+反义链+终止信号+Hind III的靶序列结构模式。在真核表达质粒psiRNA-DUO-GFPzeo（6046bp）中插入CTGFshRNA序列，再用BbsI双酶切（质粒中含两个BbsI酶切位点），再插入TIMP-1shRNA序列，形成BbsI+正义链+Loop+反义链+终止信号+BbsI的靶序列结构模式。针对CTGF和TIMP-1基因的shRNA片段序列见表1。……