微小隐孢子虫LAMP检测方法的探索＊

史亚东，董海聚，王荣军，张龙现，宁长申，菅复春

隐孢子虫是一种肠道原生寄生虫，可以引起人和动物的隐孢子虫病。该病的最主要症状是腹泻，已被列为世界最常见的6种腹泻病之一［1］，并被世界卫生组织（WHO）和美国疾病控制中心（CDC）列入新发传染病。隐孢子虫大小一般为5～8μm，常用的检测方法可以分为病原学检测（主要借助显微镜）、免疫学检测和分子生物学检测3类［2］，分子生物学检测因其优势较多而广泛应用。Noto mi等［3］2000年建立了一种快速、简单、灵敏、特异并且低成本的核酸扩增方法——环介导等温扩增法（LA MP），这种新颖的核酸扩增方法可以在短时间内简单地得出检测结果，这种优势使其在病原分子检测领域得到广泛地应用，如应用于病毒、细菌和寄生虫等病原的检测［4－7］。

1 材料与方法

1．1 虫种 本实验室保存的微小隐孢子虫（Cr yptosporidiu m par vu m）、贾第虫（Giar dia sp）、肠阿米巴（Enta moeba sp）、球虫（Ei meria tenell a）和类圆线虫（Str ongyloides sp）5种阳性样品。

1．2 主要试剂和仪器 Bst DNA聚合酶大片段（Bst DNA pol y merase lar ge frag ment）购自 NEB公司，三甲铵乙内酯（Betaine）购自Sig ma公司，Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Mar ker和脱氧核苷三磷酸（d NTP Mixt ure）购自Ta Ka Ra公司，MseI内切酶购自 Fer mentas公司，SYBR Green I（10 000×）购自Solarbio公司，E．Z．N．A．®Stool DNA Kit（粪便DNA提取试剂盒）购自OMEGA公司。电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司，型号HwS24），稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂，型号DYY－5），凝胶成像仪（SYNGENE公司，型号In－Genius L HR）。

1．3 DNA的提取 按照E．Z．N．A．®Stool DNA Kit说明书操作，对保存的不同虫株阳性样品提取DNA，－20℃保存备用。

1．4 引物设计选择及合成 袁忠英等［8］在国内首次报道用LA MP检测牛源隐孢子虫卵囊，其根据微小隐孢子虫18s r RNA基因序列（Gen Bank登录号3873244）设计了4条隐孢子虫特异性引物（F3、B3、FIP、BIP）。……