Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

张红艳，王春玉，姚 远，李彦姝，王 迪，李 丰

(1.中国医科大学细胞生物学教研室 卫生部细胞生物学重点实验室 教育部医学细胞生物学重点实验室 辽宁 沈阳 110001;2.辽宁省人民医院消化内科，辽宁 沈阳 110016)

转化生长因子β(TGF-β)超家族是一类作用繁多的细胞因子，参与细胞增殖、分化、细胞外基质改建及胚胎发育等多种细胞活动，并在多种疾病尤其是肿瘤、纤维变性类疾病及自身免疫性疾病的发病中扮演着重要角色[1-2]。TGF-β超家族包括TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)和活化素(activins)等亚类，可以通过激活多个下游信号通路行使其功能，其中Smads信号通路被认为是最关键的。Smads蛋白家族包括8个成员，分为R-Smads，Co-Smad和I-Smads 3类[3]。R-Smads包括Smad1/2/3/5/8，能够与受体结合并被受体磷酸化而激活；Co-Smad指Smad4，能够与活化了的R-Smads结合形成复合体，该复合体可进核结合DNA并与多种转录辅因子共同作用调控基因转录；I-Smads包括Smad6/7，作为R-Smads的竞争性抑制子，负向调控TGF-β通路。TGF-β信号通路受精密的调控，不同的上游配体激活不同的下游分子。TGF-β1属于TGF-β超家族的TGF-β亚类，Smad2/3/4参与该信号通路。Smad2/3/4在细胞质中与多种蛋白相互作用，如SARA[4]和PDK1[5]等。作为TGF-β1通路的重要下游蛋白，Smad2/3/4与某些相互作用蛋白的结合受TGF-β1调控。在TGF-β1作用下，PDK1与Smad2/3/4的结合减弱[5]；而Smad2与SARA的结合依赖于TGF-β1刺激[4]。本研究旨在利用基因重组技术构建pcDNA3.1myc-HisA Smad2/3/4真核表达质粒，使用标签抗体建检测Smad2/3/4在细胞中的表达，同时使用标签抗体进行免疫沉淀，质谱分析Smad2/3/4新的相互作用蛋白，进一步探索其生物学功能及在TGF-β信号通路中的功能。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞和质粒大肠杆菌DH5α感受态为本实验室制备；……