HPLC-MS/MS检测[18F]FDG中Kryptofix 2.2.2的残留量

何山震 王淑侠 王 朋 翟创彦 周志凌

1（广东省人民医院PET中心，广东省医学科学院 广州 510080）

2（广东省人民医院医学研究中心 广州 510080）

氨基聚醚(Kryptofix 2.2.2，K-222)的化学名为4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8,8,8]二十六烷，是典型的相转移催化剂[1]，广泛应用于[18F]标记放射性药物的制备，能增强[18F]的亲核性[2]，提高标记产率。

目前，[18F]2-氟代脱氧-D-葡糖([18F]FDG)是使用最多的 PET(正电子断层扫描)氟标记的示踪剂，其他[18F]标记药物也已大量应用于临床研究[3]。鉴于 K-222是高毒性物质，美国药典(USP-34)明确要求，使用[18F]FDG前须对K-222的残留量进行薄层色谱(TLC)检测[4]，其残留量须低于 50 µg/mL。

[18F]的半衰期为110 min，为提高示踪剂的利用效率，K-222的检测方法要求快速、灵敏、稳定、可靠。本研究用液相色谱质谱联用方法来检测[18F]FDG中的K-222残留浓度。

1 材料和方法

1.1 仪器与试药

K-222对照品(Sigma-aldrich，含量98%)；阿奇霉素对照品(内标，中国药品生物制品检定所，946 U·mg–1)；乙腈，色谱纯，德国默克公司；乙酸铵，质谱纯，美国Sigma公司；水为重蒸去离子水。

Shimadzu 20A高效液相色谱仪系统(日本岛津公司)；API 4000 QTrap串联质谱仪(美国ABSCIEX公司)；Analyst 1.4.2数据处理工作站。数字脉冲旋涡混合仪(美国Glas-Col公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱和质谱条件

色谱柱：ultimate XB C18(Φ4.6 mm × 150 mm，填料颗粒直径 3 µm；流动相：乙腈和 40 mmol/L NH4Ac (50:50)，流速0.85 mL/min，通过调节PEEK管的长度使其中1/3进入离子源，其余的流入废液瓶；柱温：室温；进样体积：10 µL。

离子源为电喷雾离子源(ESI源)，正离子方式检测，用于定量分析的离子对 K-222为m/z377.3–114.2 (裂解能量(CE)为 45 V)。内标为m/z749.9–158.4 (CE为55 V)，解簇电压(DP)值为100 V，扫描时间为200 ms，入口电压(EP)为9 V，出口电压(CXP)为7 V，气帘气(CUR)为137.9 kPa (高纯氮)，碰撞气(CAD)为中度，源电压(IS)为 5500 V，源温度(TEM)为 500ºC，雾化气(GS1)为 413.7 kPa (高纯氮)，加热辅助气(GS2)为482.65 kPa (高纯氮)。

1.2.2 储备液及工作溶液配制

精确称取 K-222 10 mg，配成浓度为 1 mg·mL–1的 K-222 储备液；取 10 µL 储备液，配成 10 µg·mL–1的工作液I。

精确称取阿奇霉素(内标)10 mg，配成浓度为1 mg·mL–1的阿奇霉素储备液；将储备液用 50%乙腈水溶液稀释成浓度为0.03 µg·mL–1的内标工作液。

1.2.3 示踪剂[18F]FDG的制备及样品的处理

从德国西门子RDS-111回旋加速器出质子轰击富氧水，由18O(p,n)18F反应得[18F]负离子，被经预活化的负离子交换树脂(QMA)捕获，再经含K2CO3和Kryptofix 2.2.2的乙腈溶液洗脱后进入反应管，蒸发除水后与前体1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-O-三氟甲磺酸基-β-D-甘露糖进行亲核取代反应，加入盐酸水解后得到粗产品[18F]FDG，粗产品经纯化、无菌过滤后得到临床用药。

直接取制备得到的[18F]FDG水溶液10 µL或按一定比例稀释后进样10 µL。稀释液(空白液)为制备[18F]FDG过程中不加入K-222得到的水溶液。

1.2.4 方法的专一性试验和标准曲线的制备

空白溶液进样 10 µL，获得空白液样品色谱图。以 10 µg·mL–1的 K-222 工作液 I用空白液配成浓度为 120 ng·mL–1的 K-222样品，各加入内标工作液，以空白液逐步稀释成浓度分别为120、60、20、5、1、0.5 ng·mL–1，而内标浓度为 15 ng·mL–1的标准溶液，各进样10 µL。以K-222峰面积与内标峰面积之比(y)为纵坐标，以 K-222浓度(x)为横坐标得到标准曲线。

1.2.5 方法回收率及精密度

分别配制低(LQC，1 ng·mL–1)、中(MQC，10 ng·mL–1)、高(HQC，100 ng·mL–1)浓度的 K-222 溶液质控样品各15份，分3批，每批5份，各取10 μL进样，计算质控样品的检测浓度，求得回收率和精密度，以及K-222低、中、高浓度的质控样品批内RSD和批间RSD。

1.2.6 稳定性和稀释因子考察

考察K-222低、中、高浓度的质控溶液样品，以及室温和4ºC下放置24 h后的稳定性。每个浓度5份样品，稳定性=(测定值/加入值)×100%。

配制浓度为 1、10、200 μg·mL–1的 K-222 质控溶液各 5 份，将 1、10 μg·mL–1的用空白液稀释 100倍，将 200 μg·mL–1的用空白液稀释 2000倍，考察稀释后质控的准确性。

1.2.7 基质效应考察

用2种条件下信号峰面积的平均值考察基质效应。Set1：对照品用流动相配成低、中、高浓度样品，Set2：将空白液用样品处理方法得到的上清液来配成低、中、高浓度样品，则基质效应(ME)=Set2/Set1，K-222 采用低(1 ng·mL–1)、中(10 ng·mL–1)、高(100 ng·mL–1)浓度点，内标采用一个浓度点(15 ng·mL–1)，各条件下重复测定 5个样品。

2 结果

2.1 方法专属性

分别进样空白液样品的色谱图见图1。

图1 空白液色谱图Fig.1 Chromatograms of the blank solution.

空白液加入含一定浓度内标的标准溶液，获得的色谱见图2；由图1图2，K-222、内标的出峰时间分别为3.48 min和2.53 min。

取[18F]FDG溶液样品，依同法操作，得色谱见图3。结果表明，空白液中内源性物质并不干扰K-222及内标的测定。

图2 空白液中加入 K-222 标准品(50 ng·mL–1)和内标(15 ng·mL–1)的色谱Fig.2 Chromatograms of the blank solutions spiked with K-222 (50 ng·mL–1) and internal standard (15 ng·mL–1)

图3 [18F]FDG样品溶液的色谱图3 Chromatograms of a sample taken from reaction solutions.

2.2 标准曲线及线性范围

K-222 浓度在 0.5–120 ng·mL–1呈良好线性关系，所有标准曲线的线性(r)均好于 0.99。浓度为120、60、20、5、1、0.5 ng·mL–1的标准溶液各进样 10 µL，获得代表性标准方程：y=0.508x+0.00244 (r=0.9959，权重系数为1/x2)。最低检测限为 0.5 ng·mL–1(信噪比 S/N≥9)。

2.3 方法回收率及精密度

由表1，K-222低、中、高浓度的质控样品批内 RSD在 5.2%–7.8%，批间 RSD介于5.4%–8.4%，方法回收率介于101.3%–106.6%。

表1 LC-MS/MS检测K-222的稳定性、基质效应、精密性和准确性Table 1 The stability, matrix effect, precision and accuracy of K-222 using LC-MS/MS method.

2.4 稳定性和稀释因子考察

由表1，K-222低、中、高浓度的质控样品置于室温 24 h后的稳定性分别为 98.7%、101.6%、106%，样品于 4ºC放置 24 h后的稳定性分别为99.7%、102%、107%。说明K-222在常温和较低温度下是稳定的。稀释后的准确性分别为(108.2±7.6)%、(94.4±5.7)%、(105.2±8.5)%。

2.5 基质效应考察

由表1，低、中、高浓度的 K-222和内标的基质效应分别为 100.9%、103.3%、104.0%和97.1%，可见空白液基质对低、中、高浓度药物的测定影响程度基本一致。

2.6 常规5批次[18F]FDG检测结果

随机取5批次的[18F]FDG用空白液稀释100倍后取 10 µL进样，结果列于表2。日常生产的[18F]FDG中K-222的残留量均符合USP的要求，其值均低于 50 µg·mL–1。

表2 常规[18F]FDG中K-222的检测结果(n=3)Table 2 The level in routine [18F]FDG.

3 讨论

目前，K-222的检测方法很多，如薄层色谱法[5](TLC，最低检测限为 2 μg·mL–1)、气相色谱法[6](GC，最低检测限为 0.25 μg·mL–1)、液相质谱联用法[7](HPLC-MS，最低检测限为 1 ng·mL–1)等，但都具有检测限低、低灵敏度、重现性不好、操作繁琐、样品使用量大、有专用的检测器、分析时间长、误差大等缺点。对于短半衰期的放射性药物而言，浪费了药物的使用效率，直接造成经济损失，且使操作人员接受的辐射量大大增加。

与文献[7]报道检测K-222的方法相比，本研究的标准曲线线性范围宽、灵敏度高、检测限低(0.5 ng·mL–1)、分析时间短，可在 4 min内完成 K-222的定量检测，特别适合短半衰期示踪剂药物中K-222残留量的检测。

K-222母离子经二级质谱打碎后会形成较多碎片，经比较，选取稳定性最好的m/z114.2的碎片离子与母离子(m/z377.3)组成离子对进行定量分析。

实验所用LC-MS/MS方法主要应用于[18F]标记的示踪剂中K-222残留量的测定，每次进样前在相同条件下进标准品作标准曲线。测定的结果值如果在规定范围之内(即低于 50 μg·mL–1)，该批次的药物可用于PET显像。

实验中每批需随行做两支空白管，标准曲线，6支质控(低、中、高浓度各 2支)，如所测样品浓度超出标准曲线的线性范围，则用空白将该样品按一定比例稀释，得到结果再乘以稀释倍数即可。

4 结语

研究结果表明，HPLC-MS/MS方法具有快速、简便、灵敏、稳定性好、线性范围宽等优点，适合测定短半衰期[18F]标记的示踪剂中K-222残留量的检测。

1 唐刚华. 短半衰期正电子发射放射性药物合成方法学及进展[J]. 核技术, 2003, 26(7): 551–555 TANG Ganghua. Synthetic methodology of short half-life radiopharmaceuticals for PET. Nucl Tech, 2003, 26(7):551–555

2 何山震, 王淑侠, 王朋, 等. 单管法酸水解合成[18F]FDG中反应条件的探讨[J]. 中山大学学报(医学科学版), 2009, 30(3S): 61–63 HE Shanzhen, WANG Shuxia, WANG Peng,et al. Study of influence factors on preparing [18F]FDG by hydrolyzing with HCl in single vessel [J]. Journal of Sun Yat-sen University (Medical Sciences), 2009, 30(3S):61–63

3 Peter J H, Scott, Michael R, Kilbourn. Determination of residual Kryptofix 222 level in [18F]-labeled radiopharmaceuticals for human use. Applied Radiation and Isotopes, 2007, 65: 1359–1362

4 USP 32-NF 27, 《823》Radiopharmaceuticals for positron emission tomography—compounding, Official Monographs, 2010: 933–934

5 Nakao R, Ito T, Yamaquchi M,et al. Simultaneous analysis of FDG, ClDG and Kryptofix 2.2.2 in [18F]FDG preparation by high-performance liquid chromatography with UV detection[J]. Nucl Med Biol, 2008, 35(2):239–244

6 Ferrieri R A, Schlyer D J, Alexoff D L,et al. Detect analysis of Kryptofix 2.2.2 in [18F]FDG by GC using a nitrogen-selective detector. Appl Radiat Isot, 1993, 57:697–703

7 Ying Ma, Bill X. Huang, Michael A,et al. Quantification of Kryptofix 2.2.2 in 2-[18F]FDG and other radiopharmaceuticals by LC/MS/MS [J]. Nuclear Medicine and Biology, 2002, 29(01): 125–129