山西野生卷丹百合鳞茎组织培养

马素娴，田志强，亢秀萍

（山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

卷丹百合（Lilium lanclfolium）又名虎皮百合，为百合科百合属多年生球根类花卉，鳞茎卵圆形至扁球形、黄白色，地下茎易生小鳞茎，地上茎多生珠芽[1]。其在我国各地均有野生分布，具有较高的观赏、食用和药用价值[2]。卷丹百合一般采用小鳞茎分球繁殖和珠芽繁殖，但长期营养繁殖容易造成种性退化[3-4]。

通过组织培养技术，能在短期内更新品种，生产脱毒苗，具有较高的经济价值和开发潜力。目前，国内对百合栽培种的组织培养较多[5-6]，而对适应性极广的野生种自然三倍体卷丹的研究甚少。

本研究以野生卷丹百合鳞茎鳞片为外植体，以MS为基础培养基，研究不同激素配比及添加不同质量浓度蔗糖的培养基对卷丹百合不定芽、愈伤组织及不定芽生根的诱导效果，旨在为今后野生卷丹百合大规模繁殖及生产提供理论依据与技术指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

野生卷丹百合鳞茎于2011年10月采集自山西省芦芽山自然保护区。该区地理位置为：东经 111°56′07 ″，北纬 38°45′23″，海拔为2 600 m。鳞茎于5℃低温冰箱中保存。试验中，初代培养材料为内层、中层、外层鳞茎鳞片，各处理数均为20。小芽继代培养，每个处理以20个长势均一的小芽为材料；愈伤组织继代培养，每个处理为20个长势均一的愈伤颗粒。

1.2 试验方法

将卷丹百合鳞茎用自来水冲洗干净，并用手术刀把鳞茎分成外、中、内3部分（外围2～3层鳞片为外部鳞片，中心较嫩的2～3层为内部鳞片，其余为中部鳞片），剔除腐烂的鳞片，用流水冲洗3～4 h，先用75%酒精表面灭菌30 s，无菌水冲洗2次；再在0.1%氯化汞溶液中进行灭菌，用无菌水冲洗5次。

灭菌后将每片鳞片切成0.2 cm×0.2 cm切块，接种到添加有不同激素的MS培养基上，其中蔗糖3%，琼脂0.68%，pH值为5.8。培养条件为：光照强度 2 000 lx，培养温度（25±1）℃[7]。

1.3 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel和SAS软件进行统计与分析。

小芽直径增加百分率＝（继代培养后平均直径－继代培养前平均直径）/继代培养前平均直径×100%；愈伤组织质量增加百分率＝（继代培养后平均鲜质量－继代培养前平均鲜质量）/继代培养前平均鲜质量×100%；生根率＝生根小鳞茎数/总小鳞茎数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同激素对鳞茎鳞片的诱导

将灭菌完成后的卷丹百合鳞茎鳞片切去鳞茎盘并产生切口，接种到含有不同植物激素浓度的培养基上。5 d后，外层鳞片首先变绿，其次中层鳞片变绿，内层鳞片最后变绿。12 d后鳞片切口处出现白色芽点，19 d后芽点逐渐转为绿色并开始膨大。33 d后芽点膨大为小芽，50 d后统计每个处理中内层、中层、外层鳞茎鳞片小芽数和产生愈伤组织的鳞茎鳞片数。试验结果及方差分析如表1所示。

表1 不同激素对鳞茎鳞片芽点的诱导情况

由表1可知，NAA和6-BA对鳞茎鳞片芽点及愈伤组织的诱导影响均显著。当NAA质量浓度与6-BA质量浓度比值介于1/20～1/10之间时，分化为芽点能力较高，且最佳诱导激素组合为NAA 0.1 mg/L，6-BA 2.0 mg/L；当 NAA质量浓度与6-BA质量浓度比值介于1/5～1/2之间时，分化为愈伤组织能力较高，且最佳诱导激素组合为NAA0.2 mg/L，6-BA1.5 mg/L。由表1还可知，鳞茎鳞片的分化能力内层、中层、外层依次增加。

2.2 不同质量浓度蔗糖对继代培养的影响

芽点逐渐膨大为小芽后，由于母体营养耗尽，其生长速度下降。为了保持小芽继续膨大为小鳞茎的生长速度，将其与母体材料分离，选择大小均一的小鳞茎转接到MS培养基上，通过改变蔗糖质量浓度，观察小鳞茎生长和愈伤组织生长量的变化。由于培养基在60 d后可能出现失水等退化现象，会影响材料吸收营养，因此，继代培养50 d后，测量并统计继代小芽和愈伤组织生长量。试验结果及方差分析如表2所示。

由表2可知，不同质量浓度蔗糖对小芽和愈伤组织继代培养的生长量影响显著。由图1可知，蔗糖质量浓度低时，小芽和愈伤组织的生长速度受到限制；质量浓度达到40 g/L时，愈伤组织生长量达到最大；质量浓度达到50 g/L时，小芽生长量最大，但愈伤组织生长量下降，且发生褐化现象。试验还发现，随着蔗糖质量浓度的增加，小芽由绿转变为红褐色个数明显增多；而相同质量浓度下，小芽生长量仍有增加，但增加比率有所下降。因此，继代培养小芽和愈伤组织时，可选用添加蔗糖40 g/L的MS培养基。

表2 不同质量浓度蔗糖对小芽和愈伤组织继代培养的影响

2.3 不同质量浓度蔗糖对小鳞茎生根的影响

进行小芽继代培养10 d后，发现大量小鳞茎膨大，同时底部出现黄色小点；20 d左右可明显观察到多条小根，出现生根现象。30 d统计每个小芽生根情况。统计结果及方差分析列于表3。

表3 不同质量浓度蔗糖对小鳞茎生根的影响

由表3可知，随着蔗糖质量浓度增加（由于能量物质供应充足），小鳞茎生根率和生根数明显增加。从图2，3可直观看出，当蔗糖质量浓度达到40 g/L时，生根率和生根数达到最大；蔗糖质量浓度达50 g/L时，生根率和生根数出现明显下降，且发生明显褐化现象。同时，试验时观察发现，质量浓度为40 g/L蔗糖下，新生根较添加其他质量浓度的培养基中的粗壮。因此，诱导生根可采用添加蔗糖40 g/L的MS培养基。

2.4 炼苗与移栽

将已生根的小鳞茎幼苗打开瓶盖炼苗3～7 d后，取出洗去根上的培养基，定植于装有1/3草炭＋1/3珍珠岩＋1/3河沙混合基质的营养钵内，浇透水，盖上薄膜，使其保持高温高湿的环境。其中，草炭可供以根系水分与营养物质；珍珠岩可确保基质内有空气，利于组培苗成活；河沙可增加基质排水力，提高根系呼吸强度。10 d后，逐渐揭去薄膜，让组培苗逐渐适应外界环境，缓冲2种环境下苗体的不适反应。30 d后，将营养钵内幼苗移栽至室外，正常管理，使其自然生长。

3 结论与讨论

野生卷丹百合在我国分布极广，抗性强，是少见的三倍体种。本研究表明，诱导鳞茎鳞片不定芽与愈伤组织的最佳培养基，可以通过调节6-BA与NAA不同配比实现；质量浓度为40～50 g/L的蔗糖对不定芽与愈伤组织继代培养影响较大。同时发现，质量浓度为30～40 g/L的蔗糖对不定芽生根重大意义，生根率高达89.97%。段祖安等[8]对卷丹鳞茎鳞片的诱导培养研究发现，不同质量浓度蔗糖对其分化影响效果不明显。

试验中将鳞茎鳞片分为内层、中层、外层鳞片，并观察记录整个组织培养生长情况，结果表明，各激素配比培养基中产生不定芽和愈伤组织量情况，都表现为外层＞中层＞内层，说明鳞片由内向外，生长势趋向增大。郭海滨等[9]对卷丹鳞茎、杭玲等[10]对兰州百合鳞片的组织培养研究中也得到了相同的结论。此外，将鳞片以内层、中层、外层加以区分，在灭菌过程中施以不同灭菌处理，也会对试验大有裨益。

通过本试验，得到野生卷丹百合鳞茎组织培养的有效途径与影响因素，可为野生三倍体卷丹的低成本生产与快繁提供理论依据和具体措施。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（4卷）[M].北京：科学出版社，2004：152.

[2]山西省植物志编辑委员会.山西植物志（5卷）[M].北京：中国科学技术出版社，2004：167-188.

[3]李谋智.食用百合组织培养快繁技术研究 [J].北方园艺，2006（1）：101-102．

[4]邵小斌，周翔，徐艳，等.野生百合：卷丹的组织培养初探[J].天津农业科学，2010，16（4）：18-19.

[5]陈贵华，石岭，吴玉峰.卷丹百合组织培养研究[J].内蒙古农业大学学报，2009（12）：61-64.

[6]樊兰瑛，高宏樟，郭常莲.东方百合组培快繁试验[J].山西农业科学，2008，36（9）：29-32.

[7]赵强，李庆典，赵玉岭.青岛百合的组织培养技术研究[J].北方园艺，2007（6）：213-214.

[8]段祖安，王洪利，赵艳燕，等.卷丹百合组培快繁技术的研究[J].山东农业大学学报：自然科学版，2009，40（4）：495-497.

[9]郭海滨，雷家军.卷丹百合鳞片及珠芽组织培养研究[J].中国农学通报，2006（2）：72-74.

[10]杭玲，苏宾，陈立新，等.龙牙百合组培快繁技术研究[J].广西农业科学，2001（4）：183-184.