富含γ－氨基丁酸清酒酒曲的研究

吴岱熹，吴 非

(东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

富含γ－氨基丁酸清酒酒曲的研究

吴岱熹，吴 非*

(东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

以筛选出的霉菌和大米为原料制作富含γ－氨基丁酸同时具有较高糖化酶活力的清酒酒曲。通过筛选确定了米曲霉3.800和尚志长香米为最佳组合，并对其酒曲产γ－氨基丁酸条件进行了优化。最终结果为将大米浸泡在含有7.5mg/mL VC和2.0mg/mL L－谷氨酸钠水溶液中一夜后蒸熟，然后将30℃下培养6d的米曲霉3.800以40mg/100g蒸米的接种量接种到蒸米中制作酒曲，酒曲采用变温培养，即在30℃培养20h，32℃培养4h，35℃培养14h，38℃培养8h，以此得到的酒曲中γ－氨基丁酸含量为6.936mg/g酒曲，清酒中含量为0.439mg/mL。

γ－氨基丁酸，酒曲，清酒，大米

日本清酒是低酒精度的大米酿造酒，因其气味芳香，口感绵柔，营养丰富而受到人们的喜爱。清酒酿造工艺是由我国黄酒的酿造工艺演变而成的［1］，但又有许多不同的地方。清酒采用精白度高的精米为原料，将米曲霉接种到蒸熟并冷却后的蒸米中制作酒曲。清酒最大特点是采用低温下三次投入酿造方法，即将酒曲、蒸米以及水分三次投入发酵罐中。这样可避免酸性蛋白酶的不足，使α－淀粉酶充分发挥作用，保证了酵母繁殖的一定密度，保证了发酵阶段所需的酸度和酒精含量［2］。γ－氨基丁酸(简称GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有降低血压、提高记忆力、缓解抑郁等生理功能。近年来对富含GABA食品的研究和开发日益增多，比如富含GABA的发芽糙米、茶、奶酪等［3］。有报道称蒸米中接种以L－谷氨酸钠作为底物生长的霉菌，培养后的酒曲中富集了大量的GABA［4］。提高酒曲中GABA含量对最终成品酒中GABA含量起到相当重要的作用。酒曲中菌种和大米的选择会影响酒曲中GABA含量。实验中从米曲霉接种到蒸米中时的种龄、米曲霉培养温度、酒曲的接种量、酒曲培养温度变化方式以及浸泡大米的水溶液中添加物质、物质浓度几个方面对成酒曲中GABA含量的影响进行了研究。本文目的在于探讨如何富集清酒中GABA，为发酵酒中功能性物质的富集提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

米曲霉3.800、黑曲霉3.4309、黑曲霉3.1858 黑龙江微生物研究所;米曲霉3.5232 中国科学院微生物研究所;黄酒活性干酵母 安琪公司;马铃薯培养基 用于培养米曲霉3.800;察氏培养基 用于黑曲霉3.4309、3.1858和米曲霉3.5232;γ－氨基丁酸(简称GABA) sigma试剂公司;其它所有试剂 均为分析纯。

DHP－360型电热恒温培养箱、恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂;SW－CJ－1D型超净工作台 苏州净化设备有限公司;PHS－25C型数字酸度计 上海大谱仪器有限公司;YXQ－LS－75S11型立式蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;LD－100小型粉碎机 长沙市常宏制药机械制备厂;TGL－16C型高速离心机 上海安亭科学仪器厂;UV－6000PC型紫外－可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 清酒的制作工艺

1.2.2 酿酒操作要点 a.一投是将一定量的酒曲、酒母、蒸米、水和乳酸投入到发酵罐中;二投和三投是在一投后的第2d和第3d进行(二投和三投只是将酒曲、蒸米和水投入到发酵罐中);b.安琪黄酒活性干酵母作为酒母添加;c.清酒发酵采用10℃左右的低温发酵。

1.2.3 酒曲中GABA含量测定方法 GABA含量测定:取成熟酒曲样品于60℃烘至恒重，粉碎机粉碎成细粉，过 100 目筛子［5］，精确称取 5.00g，放入 50mL 60%乙醇溶液中，于70℃水浴中浸提2h，然后以3000r/min离心5min，上清液为待分析样品［6］。取上清液1mL，加入pH为10的0.1mol/L四硼酸钠缓冲液，再加入显色剂1mL苯酚(6%)和1mL次氯酸钠(活性氯为7.5%)，沸水浴10min，立即冷水浴5min，最后加入2mL 60%乙醇溶液，在645nm下测吸光度值。

1.2.4 酒曲糖化酶活力测定方法 糖化酶活力测定:参照王福荣的酿酒分析与检测中黄酒酒曲的糖化酶活力测定［7］。

1.2.5 制作富含GABA酒曲的菌种筛选 将米曲霉3.800、3.5232，黑曲霉3.4309、3.1858 分别接种到蒸熟并冷却后的尚志长香米中制作清酒酒曲。酒曲采用变温培养(30℃ 培养 20h，32℃ 培养 4h，35℃ 培养14h，38℃培养 8h)。待酒曲成熟后，测定酒曲中GABA含量。

1.2.6 制作富含GABA酒曲的大米筛选 将米曲霉3.800分别接种到四种优质东北大米中，即尚志长香米，扎龙长粒香米，五常稻花香和纯响大米制作清酒酒曲，测定酒曲中GABA含量。

1.2.7 富含GABA清酒酒曲制作工艺的优化 采用单因素方法研究米曲霉3.800在马铃薯培养基中的培养时间(3、4、5、6、7d)，培养温度(26、28、30、32、34℃);酒曲中霉菌的接种量(20、30、40、50、60mg/100g蒸米)，酒曲的培养温度变化方式(变温和恒温培养)，浸泡米的水溶液中维生素C浓度(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mg/mL)和 L－谷氨酸钠浓度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL)［8］对 GABA 含量的影响。

1.2.8 清酒指标测定 用维生素C和L－谷氨酸钠水溶液浸泡的米做酒曲，采用1.2.1清酒酿造方法，以浸泡水中无添加的米制成酒曲而酿造的清酒作为对比。测定发酵过程中以上两个酒醪中GABA含量变化;发酵结束后，比较两种酒GABA含量和酒精度、总酸、总糖理化指标，理化指标的测定参照王福荣的酿酒分析与检测中黄酒成品分析［7］。

1.2.9 数据处理 原始数据整理采用Microsoft Excel(Office 2007)软件完成，采用 Sigmaplot 9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 制作富含GABA酒曲的菌种筛选结果

将培养成熟的四种霉菌分别接种到冷却后的蒸米中，采用变温培养方式制作酒曲，酒曲成熟后测定每种酒曲的GABA含量和糖化酶活力，结果如图1所示。

图1霉菌种类对酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影响Fig.1 Effect of mold varieties on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

从图1得出，米曲霉3.800所产GABA最多，黑曲霉3.1858和3.4309虽然产GABA也较多，但是糖化酶活力偏高。清酒酒曲中糖化酶活力范围为125～305U/g，标准活力为 250U/g［9］。米曲霉 3.800 制成酒曲的糖化酶活力为252U/g，在标准范围内。黑曲霉3.1858和3.4309糖化力明显高于标准很多，这对于清酒酒质有很大影响。太高的糖化酶活力会导致酒醪中糖类物质和酒精积聚，高糖度和高酒精度均不利于酵母菌生长，酒醪中酒精含量太多会超出清酒酒精度的范围。

2.2 制作富含GABA酒曲的大米筛选结果

实验中选择了黑龙江四种粮食著名产区的高级粳米作为清酒酒曲酿造的原料米。四种原料米和其制成的酒曲中GABA含量、糖化酶活力，结果如表1所示。

表1 大米种类对酒曲产GABA的影响Table 1 Effect of rice varieties on the production of GABA in the koji

清酒酿造中酒曲、酒母及发酵用米都必须是精白率较高的粳米，要求颗粒大、心白率高、蛋白质和脂肪含量少及淀粉含量高。原料米的品质对清酒的营养成分、口感、质地有着重要的影响。GABA的含量与稻米的品种有关［10］。因此大米种类对酒曲以及成品酒中GABA含量有影响。从表1可以看出，四种米制成的酒曲中GABA含量有显著差别，尚志长香米酒曲中含量最高。通过对比表1中大米本身和其制作的酒曲中GABA含量发现不成正比关系，这可能由于各种米中谷氨酸含量差别产生的。生物体系中GABA的产生是L－谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下生成的，如果米中底物谷氨酸含量低，可能会导致霉菌在酒曲中产生低含量的GABA。

2.3 富含GABA清酒酒曲制作工艺的优化结果

2.3.1 米曲霉3.800在马铃薯培养基中培养温度对酒曲产GABA的影响 将接种到马铃薯培养基(简称PDA培养基)中的米曲霉3.800分别在不同温度下培养，成熟后接种到蒸米中制成酒曲，米曲霉3.800在PDA培养基中培养温度对酒曲产GABA的影响如图2所示。

图2 米曲霉3.800在PDA培养基中培养温度对酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影响Fig.2 Effect of incubation temperature of Aspergillus oryzae 3.800 in PDA medium on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

微生物的生命活动是由一系列的生物化学反应组成的，而这些化学反应受到温度影响又极其明显，因此微生物的生长均有其特定的温度范围，在适宜温度范围内培养微生物能够促进其生长和代谢活动［11］。酒曲中GABA含量既与霉菌的生物量有关又受谷氨酸脱羧酶酶活的影响。图2显示，在30℃时酒曲中GABA含量最多，这是酶活和生物量两因素综合的最佳结果，此时糖化酶活力虽然不高，但是在标准范围内。

2.3.2 米曲霉3.800在马铃薯培养基中培养时间对酒曲产GABA的影响 将充分活化至活性完全恢复的米曲霉3.800传代接种到PDA培养基中培养，在培养的第3、4、5、6、7d，分别将米曲霉3.800 接种到蒸米中制作酒曲。米曲霉3.800在PDA培养基中培养时间对酒曲产GABA的影响如图3所示。

图3 米曲霉3.800在PDA培养基中培养时间对酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影响Fig.3 Effect of incubation time of Aspergillus oryzae 3.800 in PDA medium on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

从图3中看出，米曲霉3.800在PDA培养基中生长时间(即3.800接种到蒸米时的种龄)对酒曲GABA含量有影响。接入蒸米时霉菌种龄小，导致酒曲中菌丝量少，影响酒曲质量;接入时霉菌种龄大，由于菌体活力不够，会引起产酶能力的下降和菌体的过早衰老、自溶。因此，选择合适的种龄既有利于菌体的快速增长又能使得菌体产酶量达到最大［12］。GABA属于次级代谢产物，应该在霉菌生长对数期后期大量产生，在此时期接入蒸米中，霉菌的谷氨酸脱羧酶酶活应处于最高时期，利于酒曲中GABA富集。本实验中米曲霉在PDA培养基中生长到第6d时接种，生成的GABA最多，为3.783mg/g，同时糖化酶活力也很高。

2.3.3 酒曲接种量对酒曲产GABA的影响 将米曲霉3.800以不同的接种量分别接种到冷却到40℃左右的蒸米中制成酒曲，测量并比较酒曲中GABA含量和糖化酶活力，结果如图4所示。

图4 酒曲接种量对酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影响Fig.4 Effect of spore amount on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

接种量直接影响酒曲中GABA含量。接种量较少，导致酒曲中米曲霉生物量少，酒曲中各项指标达不到标准，接种量多，蒸米含量有限不足以提供充足的营养成分。如图4所示，接种量为40mg/100g(米曲霉质量/蒸米质量)时GABA最多为3.987mg/g，此时糖化酶活力也是最高的。

2.3.4 酒曲培养温度对酒曲产GABA的影响 将米曲霉以40mg/100g蒸米的接种量接种到蒸米中后，采用不同的温度变化方式培养酒曲，温度变化方式对酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影响见表2。

表2 酒曲的培养温度变化方式对酒曲产GABA的影响Table 2 Effect of koji incubation temperature on the production of GABA in the koji

酒曲培养温度是清酒品质的重要保证。35℃以下有利于提升蛋白酶的酶活，35℃以上有利于糖化酶活力的提高，而蛋白酶和糖化酶是评价酒曲质量的重要指标，因而变温能兼顾到不同酶酶活的需要。谷氨酸脱羧酶属于酸性蛋白酶，因而培养温度在35℃以下有利于GABA富集，从表2可看出，在35℃恒温下培养，富集的GABA最少。在培养酒曲过程中4次变化温度最有利于富集GABA，糖化酶活力也达到标准要求。

表3 浸泡液中不添加和添加物质的大米做成酒曲而酿造的清酒中各项指标的比较Table 3 Comparison of sake brewing parameters between rice soaking water with additives and with no

2.3.5 L－谷氨酸钠浓度对酒曲产GABA的影响 用含不同浓度的L－谷氨酸钠水溶液过夜浸泡尚志长香米，溶液的质量是大米的二倍，浸泡液中L－谷氨酸钠对酒曲产GABA的影响见图5。

图5 大米浸泡液中L－谷氨酸钠浓度对酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影响Fig.5 Effect of L－sodium glutamate concentration in rice soaking water on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

谷氨酸脱羧酶以谷氨酸为底物可以产生GABA，适当增加底物的浓度，有利于酒曲中GABA的转化。由于L－谷氨酸的价格较贵，而L－谷氨酸钠能够转化成底物谷氨酸，且价格低廉，适于作为富集GABA的底物。从图5中可以看出，在浸泡大米的水溶液中谷氨酸钠浓度为2.0mg/mL时酒曲中富集的GABA最多为5.859mg/g。

2.3.6 维生素C浓度对酒曲产GABA的影响 用含不同浓度的维生素C(简称VC)水溶液过夜浸泡尚志长香米，溶液的质量是大米的二倍，浸泡液中VC浓度对酒曲产GABA的影响见图6。

谷氨酸脱羧酶为酸性蛋白酶，添加适量的弱酸有助于创造酸性环境，提高谷氨酸脱羧酶酶活，利于GABA转化。同时GABA是生物体在逆境条件下缓解细胞酸化对自身毒害作用的产物，加入丁酸或其他弱酸均可促进GABA合成［13］。VC是食品级弱酸对人体无害，因此可选作浸泡大米水中的物质。如图6所示，当VC浓度为7.5mg/mL时酒曲中GABA最多，可能由于此浓度下溶液的pH正好处于米曲霉3.800的谷氨酸脱羧酶的最适宜pH，使酶活最大。

2.4 清酒指标测定

分别用浸泡液中添加VC以及L－谷氨酸钠和不添加以上两种物质的大米做酒曲，然后酿造清酒。测定发酵过程中两个酒醪中GABA含量的变化，测定并比较成品清酒中GABA浓度和各项理化指标，结果见图7和表3。

图6 大米浸泡液中维生素C浓度对酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影响Fig.6 Effect of vitamin C concentration in rice soaking water on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

图7 清酒发酵过程中GABA浓度的变化Fig.7 Variation of GABA concentration during the fermentation

如图7所示，用含有VC和谷氨酸钠的水溶液浸泡的米作酒曲而酿造的清酒，在其发酵过程中发酵醪中GABA的含量始终高于无添加的。从图7结果看出，在发酵前16d，两个发酵醪中GABA含量随着发酵的进行变化量很大;16d后，清酒基本成熟，GABA浓度增加缓慢，发酵醪中GABA浓度趋于稳定。添加VC和谷氨酸钠获得的酒曲GABA含量最多，为6.936mg/g，以此制得的清酒中GABA浓度如表3所示，为0.439mg/mL。从表3得出，两个发酵酒醪成熟后得到的成品清酒GABA含量差别很大，而酒精度、总糖、总酸指标差别不大，说明在浸泡米水溶液中添加VC和L－谷氨酸钠是可行的。

3 结论

不同的霉菌菌种和大米原料制成的酒曲中GABA含量差别较大，因此菌种和大米种类的选择对于提高清酒中GABA是重要的。酒曲的培养方法也会影响清酒中GABA含量。通过向浸米水中加入能够促进转化GABA的物质可以提高清酒中GABA含量。本实验筛选出米曲霉3.800和尚志长香米为原料制作富含GABA清酒酒曲，在原料确定的基础上优化了酒曲工艺，优化条件为大米过夜浸泡于含有7.5mg/mL维生素C和2.0mg/mL L－谷氨酸钠水溶液中后蒸煮，再将30℃下培养6d的米曲霉3.800以40mg/100g蒸米的接种量接种到蒸熟的米中制作酒曲，酒曲采用变温培养，即在30℃培养20h，32℃培养4h，35℃培养14h，38℃培养8h。最终获得的酒曲中γ－氨基丁酸含量为6.936mg/g酒曲，清酒中含量为0.439mg/mL。

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Study on koji with high content of gamma－aminobutyric

WU Dai－xi，WU Fei*
(College of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The varieties of rice and mold for making the koji with high content of gamma－aminobutyric(GABA)and high saccharifying enzyme activities were selected.Aspergillus oryzae 3.800 and rice from Shangzhi were selected as optimal combination，and the optimizing process conditions for koji to produce more GABA were studied.The results suggested that Aspergillus oryzae 3.800 was cultured for 6 days at 30℃ in PDA medium，and then put into steamed rice with 40mg/100g spore amount after rices were soaked in the water with 7.5mg/mL vitamin C and 2.0mg/mL sodium glutamate overnight，and more GABA was obtained after the koji was cultivated in the variable temperatures，just 30℃ for 20h，32℃ for 4h，35℃ for 14h，38℃ for 8h.6.936mg/g and 0.439mg/mL GABA were got in the koji and sake respectively in the above conditions.

gamma－aminobutyric;koji;sake;rice

TS262.4

A

1002－0306(2012)21－0188－05

2012－04－17 *通讯联系人

吴岱熹(1987－)，女，在读硕士研究生，研究方向:农产品加。