pBIFC-VN173-CXCR4 和pBIFC-VC155-NT21MP 真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用

高艳军，杨清玲，陈昌杰，丁勇兴

(1.蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心;2.蚌埠医学院生化与分子生物学教研室;3.蚌埠市中心医院普外肿瘤科，安徽 蚌埠 233030)

肿瘤转移是影响癌症患者预后的重要因素之一，而转移是由多个因素参与和多个步骤发展的过程。研究发现，趋化因子在为肿瘤细胞提供迁移信号，促进其定向转移并准确定位中可能扮演着至关重要的角色。CXCR4(chemokine receptor 4、CXCR4 和CD184)属G蛋白偶联受体家族，与其配体基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor 1、SDF-1α 和CXCL12)构成的生物学轴，可诱导肿瘤细胞趋化、转移等诸多生物学效应。CXCR4 抑制性多肽(N-terminal 21-mer peptide，NT21MP)是趋化因子巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ，vMIP-Ⅱ)N端部分氨基酸序列，可以选择性结合CXCR4 受体，通过竞争性结合CXCR4 活性位点降低CXCL12/CXCR4 信号轴的作用，进而抑制乳腺癌细胞的趋化和转移。双分子荧光互补分析技术(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)是近年来出现的一种新技术，该技术可直观地判断目的蛋白在活细胞内的定位及相互作用。本研究通过构建NT21MP 和CXCR4 的BiFC 真核表达载体，求证二者在活细胞内是否可以相互结合从而启动NT21MP 的生物学抑制效应。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞株SKBR3、非洲绿猴肾成纤维细胞株COS-7、大肠杆菌DH5α 菌及JM109 菌为本实验室保存;pBiFC-VC155 载体、pBiFC-VN173 以 及 pBIFC-VN173-JUN 和pBIFC-VC155-FOS 阳性对照载体由美国普渡大学胡长灯教授惠赠;TRIzol 试剂购自Gibco 公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)购自Sigma 公司;cDNA 合成试剂盒购自Fermentas 公司;CXCR4引物、NT21MP 均由上海捷瑞公司合成;TaKaRa Ex Taq® PCR 扩增试剂盒、限制性内切酶、PMDTM-18T 载体、T4 DNA 连接酶及胶回收试剂盒均购自TaKaRa 公司;质粒抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;退火缓冲液购自碧云天生物制剂公司。……