有机-无机杂化整体柱的制备及对尿液中倍他米松的富集分析

贾艳花 刘海燕 杨 宁 杨更亮

（河北大学药学院，河北省药物质量重点实验室，河北 保定 071002）

整体柱材料研究在过去的二十几年中取得了很大的进展，它主要分为有机聚合物整体柱[1-4]和硅胶整体柱[5-7]两大类，有机聚合物整体柱在一定的pH范围内具有良好的生物相容性，但在有机溶剂中具有溶胀作用易导致结构的变化；硅胶整体柱虽然具有一定的机械强度，但是在一定的酸性条件和轻微的碱性条件下Si-O-C键容易水解，且在干燥或热处理过程中柱床易收缩和断裂，限制了其应用，能够兼顾二者优点，避其不足[8]。本文用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷、环氧树脂三种反应物质，采用两步催化溶胶-凝胶法制备了含有长链有机结构双苯基杂化液相用整体柱，以该整体柱作为固相萃取柱，对尿样中的倍他米松进行了富集分析

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

主要仪器：P3000高效液相色谱仪（中国，北京创新通恒科技有限公司）； UV-3000紫外/可见分光检测器（中国，北京创新通恒科技有限公司）；色谱工作站CXTH-3000（北京创新通恒科技有限公司）；ODS C18柱（依利特，150mm × 4.6mm i.d.，5µm）；不锈钢空色谱柱管（10mm× 4.6mm i.d.）；SZ-97自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；HH-601 超级恒温水浴（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

四乙氧基硅烷（ TEOS 杭州硅宝化工有限公司）；γ-氨丙基三乙氧基硅烷（HG-550 杭州硅宝化工有限公司）；环氧树脂（蓝星新材料无锡树脂厂）；泊洛沙姆（PF127天津一方科技有限公司）；乙醇（天津市进丰化工有限公司）；盐酸（天津永飞化工厂）；三乙胺（天津市福晨化学试剂有限公司）；甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）；尿液由健康志愿者提供。

1.2 有机-无机杂化整体柱的制备

环氧树脂1.5g，HG-550 2mL加入5 mL的塑料离心管中，超声后混合均匀，通入氮气10min，将离心管密封，在25℃水浴中反应3h。泊洛沙姆（PF127）0.0010 g、盐酸 （0.2 mol/L）150μL、甲醇250μL、环氧树脂和HG-550反应后混合溶液190μL、四乙氧基硅烷240μL严格按照顺序加入到10mL的塑料离心管中，超声混合均匀后转移到不锈钢管中，密封，在60℃水浴4h，取出不锈钢管在线加入三乙胺适量，密封，在60℃水浴12h。分别用甲醇和水将未反应的物质冲出，即得新型有机-无机杂化整体柱。

1.3 样品的制备

精密称取适量的倍他米松标准品制备成为1.0g/L的标准储备液。将标准的储备液稀释成为0.01g/L中间储备液，用于配制5～30mg/L尿液样品（放于冰箱中保存）。

1.4 色谱条件

富集条件：整体柱（自制，10 mm ×4.6 mm）：流动相：水、流速1.0mL/min，检测波长280nm。分离的条件：C18柱（依利特，150mm × 4.6mm i.d.，5 µm）；流动相：甲醇-水（60∶40，v/v）；流速：1.0mL/min，检测波长254nm。

1.5 样品处理与色谱分析

将自制整体柱连接在液相上，按照1.4富集条件，进样品5μL，待样品走完，尿样基本冲洗干净后停泵，在整体柱的末端连接上C18柱，按照1.4分析条件进行分析，分离整体柱上富集的倍他米松。

2 结果与讨论

2.1 流速和压力曲线

以甲醇为流动相，测定整体柱的柱背压，考察了整体柱柱背压和流动相流速之间的关系。该整体柱柱背压较低，具有良好的通透性，柱背压和流速呈良好的线性关系（r=0.99925）。

2.2 整体柱材料的表征

图1是整体柱的电镜扫描图，从图中可以看出整体柱具有大小不等的孔通道的网络骨架结构，整体柱具有良好的通透性。

图1 SEM image of the cross sectional view of the monolithic column

2.3 整体柱的预处理能力

以水为流动相将5μg/mL的倍他米松标准溶液在254nm下分别进样于空柱管和整体柱，结果见图2。然后分别将5μL的尿样和5μL含有倍他米松的尿样分别按照1.5进行进样，所得的分离图图3。

图2 the solution of Betamethasone injected into the empty tube (a)and monolithic column(b)

图3 Chromatograms obtained from blank urine （a）and urine spiked with Betamethasone (b)

图2可以看以水为流动相时，在整体柱上进样时无色谱峰，说明倍他米松能很好的富集在整体柱上。从图3中可以倍他米松在9.2min出峰，尿样中无杂峰干扰测定，所以本实验制备的整体柱能够在富集倍他米松的同时除去尿液中的其它成分，可以作为检测尿中倍他米松的预处理柱。

2.4 方法验证性实验

2.4.1 标准曲线

精密量取倍他米松标准溶液，用尿液稀释成为质量浓度为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L系列的浓度梯度，按照1.5节的操作，每个浓度进样品3次。用所得色谱峰面积A对尿药浓度C（μg/mL）作标准曲线图，回归方程为标准曲线A=-1.61×104+1.89×104C，R=0.9994（n=6），在5～30mg/L范围内具有良倍他米松好的线性。当仪器的信噪比为3时，测得倍他米松的检测限6μg/L。

2.5.2 精密度与回收率

见表1。

表1 Precision accuracy and recovery of Betamethasone in urine sample

准确配制倍他米松5mg/L、15mg/L、30 mg/L 三种浓度尿液样品和同浓度的对照液各五份，尿液样品按照1.5节的过程进样分析，对照液直接进C18柱分析，实验结果如上表，绝对回收率79.44%～ 83.03%之间，日内、日间精密度均＜5.0%，精密度，准确度良好，能满足分析的要求。

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