脂联素影响体外培养肝细胞乙醛氧化酶1表达的研究

张 亮， 陈志强， 文 剑

(东南大学医学院附属第二医院检验科，江苏南京210003)

脂联素(adiponectin，APN)是目前发现的一种特定能降低肥胖患者器官脂肪化的蛋白质，特别是能避免肝脏的非酒精性脂肪化、纤维化［1-3］。现有研究表明乙醛氧化酶1(aldehyde oxidase-1，AOX1)的活性与氧自由基相关，而氧自由基能导致细胞发生损伤和纤维化［4-6］。本课题组前期研究表明，AOX1在非酒精性脂肪肝脏病变(nonalcohol fatty liver disease，NAFLD)细胞中大量表达［7-8］。我们通过研究APN对体外培养肝细胞AOX1分泌的影响规律及机制，探讨其对NAFLD的治疗效果及机制。

材料和方法

一、试剂及材料

细胞培养所用试剂RPMI 1640培养基与胎牛血清均来自Gibco公司，APN由Sigma公司提供。5%CO2培养箱为Thermo公司产品，百级生物安全柜为Esco公司产品。逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒为Sigma公司产品，免疫印迹法采用ECL Western-blot检测系统。

二、细胞培养

试验所用肝癌细胞株HepG2及肝细胞株HL-7701均购自中科院上海细胞库，均用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)1640培养基培养，细胞传代时使用含5%乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化细胞为细胞悬液，并用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤3次，用含FBS培养基重悬细胞为细胞悬液并移植进入新的培养瓶中，细胞种植浓度＞105/mL。

三、脂肪性肝细胞模型建立及APN孵育细胞

采用饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)孵育2种肝细胞，SFA浓度为100μmol/L，孵育24 h后检测AXO1在细胞中的表达。SFA孵育完成后，将不同浓度APN加入细胞培养瓶中孵育细胞，APN 浓度为0.5、1.0、1.5、2.5 μg/mL，与细胞共培养24 h后，用胰蛋白酶将细胞消化成细胞悬液，以待进一步检测。

四、实时RT-PCR

基因表达采用RT-PCR实时检测［7］。AOX1及β-肌动蛋白(β-actin)引物序列见表1。在试验过程中，AOX1用45次循环，β-actin采用40次循环。……