加拿利海枣叶斑病抑菌试验

冯福娟，佘德松

（丽水职业技术学院，浙江 丽水 323000）

加拿利海枣（Phoenix canariensis）原产于非洲西岸的加拿利岛，其树形张开呈半圆形，远观如同撑开了的罗伞，富有热带风情，是国际著名的景观树种。该树种于20世纪80年代开始引入我国，现在长江流域及以南地区广泛应用于园林绿化，以烘托热带韵味。但由于生长环境的变化和管理方面的原因，许多栽种的加拿利海枣出现了生长不良的现象，叶斑病就是其中普遍而且严重的一种现象。加拿利海枣叶斑病主要危害叶片，其症状为叶局部变淡黄至棕褐色，叶尖病斑多，形状大小不一[1]。有些地区由于叶斑病的危害，导致叶片枯死，甚至植株死亡，严重影响绿化效果。苗期为害更重，严重影响了种苗的商品价格，对花农造成严重的经济损失。为了提高加拿利海枣叶斑病的防治效果，我们开展了对加拿利海枣叶斑病病原的分离培养和农药抑菌试验。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离培养

1.1.1 材料选取 采集丽水职业技术学院校园绿化带的加拿利海枣叶斑病的新鲜病叶，带回室内作分离材料。

1.1.2 培养基配制 病菌分离培养所用培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）。制作方法：将马铃薯洗净去皮切块称取200 g，将其切成正方形小块，放入铝锅中加水1 000 mL煮沸20 ～ 30 min，直至马铃薯酥而不烂，用纱布过滤，定容至1 000 mL，加入琼脂18 g、蔗糖20 g，加热并用玻璃棒不停搅拌至琼脂完全溶化后分装到锥形瓶中，封口包装，高压蒸汽灭菌后备用。

1.1.3 病原菌的分离与纯化 病原菌分离采用植物组织分离法。将加拿利海枣叶斑病病叶用清水洗净，用刀片从加拿利海枣叶斑病典型病斑的病健交界处切取5 mm×5 mm的小组织块若干。在消毒后的超净工作台上无菌操作制作培养基平板。将病组织块先用70%酒精浸2 ～ 3 s，再用0.1%升汞消毒1 min，然后用灭菌水冲洗3次洗净药液。用镊子将消毒过的组织块移接到平板培养基上，每皿放5块呈梅花状排列。在培养皿上贴上标签，然后倒置于26℃的培养箱中培养。菌落长成后，用接种针或环挑取分离培养出的菌落边缘的菌丝，转接到试管斜面培养基中，置于26℃的培养箱中培养得到纯菌种。

1.1.4 病原菌的鉴定 观察菌落菌丝特征，并将纯化得到病菌制成临时玻片标本，置于显微镜下观察镜检其形态，依据菌落、菌丝和孢子特征，对照有关文献确定病原菌种类。

1.2 病原菌的农药抑菌试验

1.2.1 供试农药及浓度 本试验选用了6种农药。80%代森锰锌可湿性粉剂，郑州志信农化有限公司生产；10%苯醚甲环唑水分散粒剂，绩溪农华生物科技有限公司生产；40%百菌清悬浮剂，东莞市瑞德丰生物科技有限公司生产；450 g/L咪鲜胺水乳剂，陕西恒田化工有限公司生产；80%乙蒜素乳油，南阳卧龙农药厂生产；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂，北京达世丰生物科技有限公司生产。

供试农药浓度以说明书上的有效使用浓度为依据，每种农药选3种浓度，代森锰锌、百菌清、甲基硫菌灵、乙蒜素分别配制了800、900和1 000倍液；苯醚甲环唑和咪鲜胺分别配制了1 000、1 500、1 800倍液。

1.2.2 试验方法 采用水平扩散法中的滤纸片法[2]，并作了一定改进。操作方法如下：

1.2.2.1 菌液制备 将培养好的有大量孢子的病原菌移入带玻璃珠已灭菌的无菌水中，振荡摇匀，高倍镜下镜检每视野20 ～ 30个孢子为度。

1.2.2.2 PSA培养基平板制备 在灭菌培养皿中倒入15 mL左右的PSA培养基，等冷却凝固后备用。

1.2.2.3 抑菌试验 将制备的菌悬液取 1滴，移入培养平板表面，用玻璃涂捧涂布均匀；将圆滤纸片浸入农药药液中1 min，再将圆滤纸片移入带菌平板中，每培养皿移入3片，均匀排列。每种农药每个浓度3个重复，以清水对照，贴上标签，将制好的培养皿倒置恒温箱26℃培养，随时观察抑菌圈大小及变化。

1.2.2.4 抑菌圈的测量 以通过圆滤纸片中心的两次相互垂直的抑菌圈的平均值作为该药纸片的抑菌直径。将同一个培养皿内的3个药纸片的抑菌直径作为该培养皿的平均抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 加拿利海枣叶斑病病原

分离培养后3 d出现菌落，菌落平展，表面长绒毛状，菌丝白色，边缘整齐，培养基淡黄色。第5天菌落中心出现黑色液滴，为病菌分生孢子堆，聚成黑色焦油状。培养过程，未发现有性阶段。

镜检特征：菌丝有隔，分枝多，无色。分生孢子大，纺锤形或梭形，直，极少弯曲；中间有4个分隔，多数5个细胞，中部3个褐色，两端细胞无色；顶端有3根附属丝，少数2根或4根[3]（图1）

根据以上特征鉴定其为半知菌亚门、黑盘孢目、拟盘多毛孢属的掌状拟盘多毛孢（Pestalotiosis palmarum）。

2.2 抑菌试验结果

抑菌试验在培养36 h后，出现明显的抑菌圈，抑菌圈大小见表1。

图1 病原菌分生孢子的形态特征Figure1 Characteristic of conidia

从表1可以看出，选择的6种农药对加拿利海枣叶斑病菌都有较好的抑制作用。对菌丝生长的抑制能力由强到弱依次为10%苯醚甲环唑水分散粒剂、450 g/L咪鲜铵水乳剂、80%代森锰锌可湿性粉剂、40%百菌清悬浮剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、80%乙蒜素乳油，其EC50依次为0.167 2、0.283 2、2.946 4、4.138 9、5.978 6、9.2409 mg/L。

表1 6种杀菌剂抑制菌丝生长毒力测定结果Table1 The toxicity test of 6 fungicides against the mycelia

3 小结与讨论

用加拿利海枣叶斑病新鲜病叶经分离培养、纯化、鉴定，其病原为半知菌亚门、黑盘孢目、拟盘多毛孢属的掌状拟盘多毛孢（Pestalotiosis palmarum）。6种杀菌剂从EC50上看，抑菌效果为10%苯醚甲环唑水分散粒剂＞ 450 g/L咪鲜铵水乳剂 ＞ 80%代森锰锌可湿性粉剂 ＞ 40%百菌清悬浮剂 ＞ 70%甲基硫菌灵可湿性粉剂 ＞ 80%乙蒜素乳油，最小值为0.167 2 mg/L，最高值为9.240 9 mg/L。因此，6种杀菌剂生产上都可用于防治加拿利海枣叶斑病。

[1]金亮，丁印龙.厦门地区主要棕榈植物病害种类普查鉴定及其防治[J].热带农业科学，2000（4）：12－19.

[2]丁爱云.植物保护学实验[M].北京：高等教育出版社，2004：83.

[3]陆家云.植物病原真菌学[M].北京：中国农业出版社，2001.：476.