OCIL shRNA表达载体的构建及其对成骨细胞RANKL/OPG基因表达的调节*

王 君 郑 纺 王宝利

核因子κB受体活化因子配基（RANKL）与其靶信号受体核因子κB受体活化因子（RANK）及诱饵受体护骨素（OPG）是调控骨吸收最重要的细胞因子系统[1-2]，是其他多数骨吸收调控因子的媒介[3]。破骨细胞分化抑制因子 （osteoclast inhibitory lectin,OCIL）是近年来新克隆的Ⅱ类跨膜C型凝集素，其组织分布与RANKL/OPG系统相似[4-5]。体外研究表明OCIL直接抑制小鼠黏附性脾细胞向破骨细胞样细胞的分化，提示破骨细胞前体上可能存在着OCIL受体，OCIL可以直接作用于该受体而影响破骨细胞分化[4]。但本研究小组前期研究显示，OCIL的抗破骨细胞生成作用与其影响骨髓基质细胞/成骨细胞RANKL/OPG系统的表达有关[6]。本研究旨在探讨成骨细胞中OCIL基因表达下调后骨吸收相关基因OPG和RANKL mRNA表达水平的变化，以及其对破骨细胞生成的影响。

Table 1 shRNA coding sequences of rat OCIL mRNA表1 大鼠OCIL mRNA的shRNA寡核苷酸序列

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 大鼠UMR106细胞株为本室保存。小干扰表达载体pRNATU6.1/Neo（GenScript公司）。脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000、G418（美国 Invitrogen公司），MMLV逆转录酶 （Promega公司），SYBR誖Green Master Mix（TOYOBO 公司），TRI试剂（Molecular Research Center）。质粒高纯度提取试剂盒购自天根生物有限公司，甲状旁腺素（PTH）购自北京康肽生物技术公司，寡核苷酸合成和DNA序列分析由上海英骏生物技术公司完成。实时荧光PCR分析在罗氏LightCycler 2.0荧光定量PCR系统上进行。

1.2 方法

1.2.1 OCIL shRNA表达载体的构建与鉴定 使用GenScript公司网站提供的siRNA Target Finder和siRNA Construct Builder（http://www.genscript.com/rnai.html）软件设计针对大鼠OCIL mRNA的 233、914、1301位点的 3对siRNA编码序列，在序列两端加上限制性内切酶酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ的切割后末端及10 bp环状的发夹样结构序列，分别命名为N1、N2和N3，见表1。采用本研究前期方法[7]将N1、N2和N3的序列分别通过Bam HⅠ和HindⅢ位点克隆于pRNATU6.1/Neo载体。……