响应面法优选浙贝母中总生物碱的超声波提取工艺Δ

严优芍，钟伟健，孙 悦（1.广东药学院中药学院，广州 510006；.广州市公安司法鉴定中心，广州510030）

浙贝母为百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鳞茎，具有清热化痰、止咳、开郁、散结之功，是一种常用的化痰中药。中医理论认为，痰在肿瘤的形成机制中占有重要的地位，故在治疗肿瘤的处方中经常可见浙贝母的应用。现代研究表明，浙贝母具有逆转肿瘤多药耐药的作用，其主要有效成分为生物碱[1，2]。笔者采用响应面法对浙贝中总生物碱的超声波提取工艺进行优选，为进一步研究浙贝母奠定基础。

1 仪器与试药

UV-2450紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；SK8200LHC超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）。

浙贝母（广东省药材公司中药饮片厂，批号：20101210）；贝母素乙对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110751-200608）；水为重蒸馏水，乙醇、盐酸、氨水、氯仿、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、溴麝香草酚蓝等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总生物碱的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的贝母素乙对照品2.52 mg，置于25 mL量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取浙贝母粉末5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入适量75%乙醇，超声（频率：53 kHz）至一定时间，取出，滤过，滤液蒸干，残渣加2%的盐酸分次溶解，滤过，滤液用氨水调pH值为11，氯仿萃取3次，每次20 mL，合并萃取液于100 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 线性关系考察[3，4]精密吸取贝母素乙对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于分液漏斗中，分别加氯仿使成25 mL，再加pH 5.0的苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲溶液2 mL和0.001 mol·L－1的溴麝香草酚蓝溶液2 mL，强力振摇，静置待完全分层，分取氯仿层于已加入0.25 g无水硫酸钠（105℃干燥4 h）的25 mL干燥量瓶中，密塞，摇匀。随行空白对照，在410 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，贝母素乙检测浓度（c）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝0.0517+0.0311c（r＝0.9996，n＝5）。结果表明，贝母素乙检测浓度在4.032～20.160 mg·L－1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.4 样品含量测定 精密吸取供试品溶液5 mL，置分液漏斗中，按“2.1.3”项下“加氯仿使成25 mL”起操作。随行空白对照，在410 nm波长处测定吸光度，代入回归方程计算含量，并按下式计算总生物碱得率：总生物碱得率＝[（A－0.0517）×V×N]/（0.0311×W×106）×100%。式中，A为吸光度；V为样品溶液体积（mL）；N为稀释倍数；W为取样量（g）。紫外吸收光谱见图1。

图1 紫外吸收光谱Fig 1 UV spectra

2.2 单因素试验

2.2.1 提取时间的选取 精密称取浙贝母粉末5份，每份5 g，各加入20 mL75%乙醇，置超声仪（功率：400 W，频率：53 kHz）中分别处理15、30、45、60、75 min，滤过，滤液按“2.1”项下方法测定总生物碱含量，并计算总生物碱得率。结果，当提取时间为45 min时总生物碱得率最大，之后随提取时间增加得率反而缓慢下降，具体影响见图2A。

图2 各因素对浙贝母中总生物碱得率的影响Fig 2 Effects of each factor on the yield of total alkaloid from F.thunbergii

2.2.2 超声波功率的选取 精密称取浙贝母粉末5份，每份5 g，各加入20 mL75%乙醇，分别置超声仪中以不同功率（频率恒定为53 kHz）处理45 min，滤过，滤液按“2.1”项下方法测定总生物碱含量，并计算总生物碱得率。结果，总生物碱得率在超声波功率达到400 W之前随着功率的升高而增加，但在超声波功率＞400 W后，总生物碱得率明显下降，具体影响见图2B。

2.2.3 液料比 精密称取浙贝母粉末5份，每份5 g，分别加入20、25、30、35、40 mL75%乙醇，置超声仪（功率：400 W，频率：53 kHz）中处理45 min，滤过，滤液按“2.1”项下方法测定总生物碱含量，并计算总生物碱得率。结果，随着液料比的增大，总生物碱得率随之提高。但当液料比＞6（mL∶g）时，总生物碱得率有下降趋势。由于液料比过大，溶剂用量和下一步浓缩工艺的能耗都会增加，因此初步确定液料比为6（mL∶g），具体影响见图2C。

2.3 响应面法优选超声波提取工艺

通过单因素试验可初步确定提取时间、超声波功率、液料比3个参数的量，在此基础上采用3因素3水平的Box-Behnken试验设计法进行试验方案设计。因素水平见表1（每个因素的低、中、高水平分别记作－1、0、1）；试验设计方案和结果见表2。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken试验设计方案和结果Tab 2 Scheme and the results of Box-Behnken experiment design

方案中试验号1～12为析因点试验，而13～15为零点重复试验，用于估计试验误差。试验结果以总生物碱得率为响应值，利用Design-Expert8.0.5软件对数据进行多元回归拟合，得到浙贝母中总生物碱得率（Y）对提取时间（A）、超声波功率（B）和液料比（C）的二次多项回归模型：Y＝0.17+0.006A+0.007B+0.007C－0.0003AB－0.002AC－0.001BC－0.010A2－0.021B2－0.012C2（r＝0.9948），表明响应值Y的实际值与预测值之间具有较好的拟合度。方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

由表3可知，模型整体达极显著水平（P＜0.01），失拟项不显著，表明该二次方程模型比较显著，该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的浙贝母中总生物碱得率进行预测。A、B、C、A2、B2、C2为极显著因素（P＜0.01），它们对总生物碱得率有极显著影响；而AB、AC、BC三项的P值均＞0.05，说明各因素之间的交互作用不显著。经软件优化，当A＝0.2、B＝0.2、C＝0.3时，可使回归方程中Y值最大：0.1696。通过编码值与非编码值之间的换算，可得浙贝母中总生物碱超声波提取最佳工艺为提取时间48 min、超声功率420 W、液料比6.6（mL∶g），在此条件下，总生物碱得率为0.1696%。

2.4 验证试验

为检验模型预测的准确性，按上述最佳工艺进行3次平行试验。结果，平均总生物碱得率为0.1685%，与理论预测值的相对误差为0.65%，预测值与试验值之间良好的拟合性证实了该模型的有效性。

3 讨论

现有文献多采用正交设计法优化浙贝母的提取工艺。与正交设计相比，响应面法在试验条件寻优过程中，可以连续地对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。同时，响应面法通过中心组合试验，可研究几种试验因素间的交互作用，求得高精密度的回归方程。因此，该方法在试验设计中具有一定优势，目前在中药研究中的应用也日益广泛。

笔者在单因素试验的基础上，将响应面法应用于优选浙贝母中总生物碱超声波提取工艺，通过拟合方程得到浙贝母中总生物碱超声提取的最佳条件；且回归分析结果表明，回归模型极显著，验证值和预测值吻合较好，说明模型预测可靠，可用于浙贝母中总生物碱超声波提取工艺的优选。

[1]胡凯文，陈信义.中药活性成分抗耐药肿瘤细胞体外筛选研究[J].中国医药学报，1998，2：10.

[2]胡凯文，郑洪霞，齐 静，等.浙贝母碱逆转白血病细胞多药耐药的研究[J].中华血液学杂志，1999，20（12）：650.

[3]朱治富，李国元，赵 成.酸性染料比色法测定乌贝散中浙贝总生物碱的含量[J].安徽医药，2003，7（3）：222.

[4]刘喜纲，刘翠哲，常金花.应用酸性染料比色法测定总生物碱的含量[J].中国药房，2007，18（11）：875.