APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

黄 巍，周丽荣，周 婷，孙红霞，黄晓刚，刘 桥

(武汉市医学科学研究所基础医学研究室，湖北武汉 430014)

阿尔采末病(Alzheimer’s disease，AD)发病机制复杂，其中 β-淀粉样蛋白(amyloid β protein，Aβ)胞内外异常过量产生、聚集和沉积，是导致AD老年斑形成和神经元毒性的确切病理现象和重要诱因。Aβ由I型跨膜的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经分泌酶水解代谢产生，按作用位点可分为α、β和γ 3种，α和β分泌酶(β-site APP-cleaving enzyme，BACE)先竞争性的水解 APP，然后γ分泌酶再水解剩下的APP片段产生各自代谢产物。Aβ由β和γ分泌酶依次水解APP产生［1］，具有毒性;α和γ分泌酶依次水解APP，产生的可溶性sAPPα肽和P3肽段则具有神经营养等作用。若APP的α和β代谢失去平衡，产生过多的Aβ，就容易诱发AD。

APPβ分泌酶切割位点是Aβ产生的关键位点，容易受到周围空间环境影响，如将Aβ抗体与APP结合，当抗体识别位点靠近Aβ的N端，即靠近APP的β切割位点，则Aβ的产生会受到干扰［2］，抗体识别位点正好为APPβ分泌酶切割位点序列时则作用更直接［3-4］，提示APPβ位点可以作为一个药物设计的良好靶点。我们在研制抗人APPβ分泌酶水解位点的单克隆抗体(mAb)的基础上［5］，进一步研制特异性单链抗体(ScFv)，ScFv相对mAb具有免疫原性弱，组织穿透力强，更容易通过血脑屏障等特点。APPβ分泌酶切割位点抗体与Aβ抗体在识别序列和减低Aβ机制上都有所不同，前者的目的是阻碍β分泌酶进入作用位点，切割APP产生Aβ，后者则是激活免疫系统，溶解清除已产生的Aβ，见Fig 1。

Fig 1 The delineation of APP degradation

1 材料与方法

1.1 材料 分泌抗人APPβ分泌酶水解位点单克隆抗体细胞株1A7和2H10［5］，以及稳定转染pEGFP-hAPP751(+4G)的 CHO细胞株(过表达人APP751和GFP融合蛋白)［6］由本室制备保存。……