菲黄竹叶片色素含量、结构与颜色之间关系初探

王啸晨 张 磊 岳祥华 高志民

（1 国际竹藤中心 竹藤科学与技术重点开放实验室 100102 北京2 山东省龙口市园林管理处 龙口 265701 3 国际竹藤中心安徽太平试验中心 安徽黄山 245700）

植物彩色叶片是园林景观中的重要组成要素之一，因其鲜艳的色彩而成为人们关注的焦点。中国竹文化历史悠久，赏竹、咏竹早在古代就已盛行。近年来，观赏竹因其亮丽的色彩和独特的气质倍受青睐，而成为园林绿化彩叶地被、色块或山石盆景栽观赏的重要植物材料之一，其中地被观叶竹种逐渐受到研究者们的关注。菲黄竹（Sasa auricoma）为禾本科赤竹属的混生竹，是良好的地被竹种，其嫩叶纯黄色具绿色条纹而颇具观赏价值。随着人们对菲黄竹观赏性的认知，对其快速繁殖[1,2]、抗逆性[3-5]、光合生理[6]、叶绿素荧光动力学[7]等的研究也不断深入，对菲黄竹在园林中的推广应用起到了积极的作用。然而，对于竹子叶片彩色的研究却鲜有报道。

研究表明，植物叶片的形态结构及其色素种类与含量是影响叶片颜色的重要因素。例如，对常见彩叶植物的色素组成与叶色关系的研究表明，各种色素的相对含量是导致叶色不同的主要原因[8]；叶绿素a的显著减少是导致吊兰色叶形成的直接原因[9]；4种李属彩叶树种枝叶花色苷分布的解剖研究表明，花色苷在叶片中的分布范围与花色苷含量呈正相关[10]；对玉簪叶绿体超微结构观察发现，随着叶片从绿色部分-过渡色部分-黄色部分的渐变，叶绿体出现由椭圆形转变为圆形、基粒类囊体肿胀、囊泡产生和噬锇颗粒增多的变异现象[11]。对白纹阴阳竹(Hibanobambusa.tranquillans f. shiroshima)和白纹椎谷(Sasaella.glabra f. albo-striata)的研究表明，1层或2层叶肉细胞叶绿体发生变异叶色呈现为浅绿色的条纹，细胞内叶绿体全部变异叶色为白色或浅黄色[12]。本研究以菲黄竹为材料，通过对其叶片色素含量的测定、解剖结构的观察，来探讨其与叶片呈现颜色之间关系，以期为了解花叶竹种的成色机理，研究竹子色素代谢途径提供参考，为竹类植物遗传育种和品种改良提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

菲黄竹分株苗引自国际竹藤中心安徽太平试验中心，盆栽于国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室，培养条件为温度25 ℃；光照500 μmo1/(m2•s)；光周期光/暗=16 h/8 h。

1.2 方法

1.2.1 叶片色度测定

选取生长健康成熟的新鲜叶片，应用RHSCC比色卡（英国皇家园艺协会）对叶片条纹的色度进行测定，记录色度值。

1.2.2 叶绿素a、b及类胡萝卜素含量测定

剪取叶片，用清水洗净擦干，分别取叶片的绿色区和变色区部分，称取0.2 g样品，剪碎后放入含少量石英砂和碳酸钙的研钵中，加入80%丙酮的15 mL，在弱光下研磨后，静置5 min。用定性滤纸过滤，滤液定容到25 mL。应用分光光度计（UV-3300）测定滤液在663 nm、646 nm和470 nm下的光密度值，按照文献方法[13]分别计算色素含量。试验重复3次，统计数据分析并作图。

1.2.3 黄酮类物质测定

取新鲜叶片0.2 g，用2 %甲酸（甲醇抽提黄酮类物质）黑暗条件下4 ℃浸提24 h，每12 h振荡一次。抽提液用定性滤纸过滤后，加入等体积石油醚萃取，1 h萃取一次，致醚相无色。极性相再用0.22 μm的尼龙微孔滤器过滤后，用于HPLC分析。层析柱使用Thermo公司的Hypersil Gold反相高效液相色谱柱，流动相如下，A相：甲酸:水（1:9，V:V）；B相：乙腈:甲醇（85:15，V:V）。上样后采用以下洗脱程序：0～50 min（5%～30% B相），50～60 min（30% ～5% B相）；流速1 mL/min；进样量10 μl；柱温35 ℃。检测波长为525 nm和350 nm。

1.2.4 石蜡切片制作与观察

将叶片不同条纹切成约为0.5 cm×0.5 cm小块，迅速投入FAA固定液中，抽真空后固定48 h。按照文献[14]方法脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡，用番红-固绿双重染色，中性树脂封片，将样品制成6～8 μm的切片。用光学显微镜（OLYMPUS CX31）观察叶片横切面结构。

1.2.5 透射电镜样品制作与观察

分别取叶片的绿色区和白色区，切成1 mm×1 mm，按照文献[11]方法固定、脱水、包埋、固化，使用超薄切片机（LEICA UC61）切成70 nm的切片，用3%的醋酸铀-柠檬酸铅双染色，利用透射电镜（FEI Tecnai G2T）观察。

2 结果与分析

2.1 叶片色度及色素含量

应用RHSCC比色卡测定结果显示，菲黄竹叶片近轴面和远轴面的条纹色度存在着一定的差异，近轴面绿色区域色度为137A和144A；亮黄绿色区色度为150B；而远轴面绿色区色度为137C和141A；亮黄绿色区色度为2C。

色素含量测定结果表明，菲黄竹叶片绿色区域的叶绿素总含量为994.02 μg/g，明显高于亮黄绿色区的含量（654.16 μg/g），但叶绿素a与叶绿素b的比值却是亮黄绿色区高于绿色区域（表1）。类胡萝卜素的含量绿色区域为158.46 μg/g，亮黄绿色区域为150.60 μg/g，差异不明显。绿色区域叶绿素总含量与类胡萝卜素总含量的比值为6.27:1，亮黄绿色区域为4.34:1。

表1 菲黄竹叶片不同区域叶绿素含量

反相高效液相色谱检测结果显示，菲黄竹叶片的绿色区域叶片和变色区域在525 nm处的吸收峰最高都不超过0.005 AU，判断其中花青素类物质可忽略不计（图略）；而在350 nm检测到黄酮类物质的组分（黄酮和黄酮醇），组分的保留时间、峰值面积都比较一致（图1），表明绿色区域与亮黄绿色区域的黄酮类主成分基本一致，且含量差异不显著。

图1 菲黄竹叶片黄酮类物质HPLC分析

2.2 叶片解剖结构

对叶片石蜡切片观察的结果显示（图2），叶片不同颜色区域的表皮细胞间没有显出差异，叶片上、下表皮均由1层细胞构成，外壁有角质层；上表皮细胞为椭圆形，大小均匀，间有3～5个并列的泡状细胞；下表皮细胞不规则，体积较上表皮细胞略小，有较多的突起外缘，基本覆盖整个下表面；叶缘并列有8～10个1组的泡状细胞。叶片内部的维管束都没有呈现花环状结构；叶肉组织由3～4层细胞构成，没有栅栏组织与海绵组织的界限，内部分布有空腔。不同颜色叶片区域的石蜡切片在组织染色后没有出现差异。

图2 竹子叶片横切显微结构

超薄切片观察表明（图3），菲黄竹叶片不同颜色区域叶片的上表皮和下表皮中均未发现叶绿体，并且叶片的颜色不受表皮结构影响，因此只对叶肉细胞进行了超显微观察。超显微结构观察表明，叶片的绿色区域和变色区域都有完整的叶绿体，并且叶绿体类囊体排列整齐，数量上也没有明显差异。

图3 菲黄竹叶绿体超微结构

3 小结与讨论

已有研究表明，植物叶片的结构是引起叶色变化的重要因素之一，对花叶烟草(Nicotiana tabacum)的研究表明，叶片绿色部分的叶绿体结构与野生种相似，而白色部分没有发育为成熟的叶绿体[15]。菲黄竹叶片颜色呈现不同的色度，对不同颜色区域研究的结果表明：叶片绿色区域和亮黄绿色区域的组织结构从形态上没有差异，超微结构显示2部分区域的叶绿体结构发育正常，说明叶片的组织结构不是引起叶片不同区域颜色变化的原因。

对花叶玉簪叶片绿色部分、过渡色部分和黄色部分的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b以及叶绿素总含量测定结果显示，叶绿素a含量的递减和叶绿素b含量的递增是导致叶绿素a/b和叶绿素总含量递减的原因[11]。本研究对菲黄竹叶片色素含量的测定表明，绿色区域和亮黄绿色区域的所含花青素类和黄酮类物质趋于一致，类胡萝卜素的含量差异不明显，但是叶片绿色区域的叶绿素总含量明显高于亮黄绿色区。这意味着引起菲黄竹嫩叶期叶片呈现不同色度的主要原因是叶片中的叶绿素含量。

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