微小核糖核酸在参与缺血/再灌注过程中的研究进展

黄邓君(综述)，魏煜程，沈 毅(审校)

(青岛大学医学院附属医院胸外科，山东青岛 266000)

微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)是一种5'端带磷酸基团、3'端带羟基，长度为18～25个核苷酸存在于真核生物中的非编码调控RNA，现已证实miRNA通过与靶mRNA结合以及调节靶mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因的表达。既往已有关于miRNA与肿瘤之间的相关性研究，因缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/R)是器官移植术后的重要难题，故如今研究的重点已转向miRNA参与I/R过程中细胞凋亡、增殖与分化以及炎性反应的研究上。现简要介绍miRNA在参与I/R过程中的研究进展，以期在分子水平上为早期诊断及干预I/R提供理论依据。

1 miRNA概述

1.1 miRNA的发现 1993年Lee等［1］首次在秀丽隐杆线虫发现 miR-lin-4，随后科学家 Reinhart等［2］在线虫中发现另外一种miR-let-7。目前在人类、动植物等物种中已有8000余种miRNA被发现，这些miRNA的序列在进化关系较近的物种间具有保守性，人类基因组中已确认的有800多种，参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡［3-4］。

1.2 miRNA的形成及其作用机制 核酸酶Drosha在胞核内加工miRNA的初始转录产物(初miRNA)成为miRNA的前体［5］，miRNA的前体由60～90个核苷酸构成，呈茎环结构，细胞核内的miRNA前体由Ran-GTP酶以及其受体输出蛋白-5转运出细胞核进入细胞质中，并由胞质中的RNaseⅢ-Dicer酶剪切出成熟的双链miRNA。通常情况下，双链RNA中的一条单链会与核糖核蛋白形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，另一条链发生降解;当然也有一些miRNA双链会分别与不同的核糖核蛋白结合。RISC通过miRNA的指导与靶mRNA结合从而剪切靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译(两种方式)来执行miRNA的基因沉默功能［6］。RISC与靶mRNA的结合若是部分互补的，则可抑制靶mRNA的翻译;若其结合是完全互补的，则可降解靶mRNA。在植物中通常采用第一种方式，第二种方式通常在动物中发生。例如果蝇的let-7直接介导RISC剪切靶mRNA;而当与靶mRNA不完全互补结合时，调节基因的表达;线虫中的1et-7与靶mRNA不完全配对结合后，抑制靶 mRNA 的翻译［7］。Wu等［8］提出另外一种去腺苷酸化机制参与miRNA的基因调控。其依据是已知lin-28与miR-125b呈不完全互补方式结合，当把miR-125b转入人类胚胎肾细胞293T后发现连接了lin-28的p-球蛋白mRNA明显缩短，这种缩短与腺苷酸的清除有关。一个miRNA可调节数个甚至数百个不同的靶mRNA，而几种不同的miRNA也可以联合调控单一的靶mRNA，miRNA和靶mRNA组成了复杂的调节网络系统［9］。

1.3 miRNA的命名 miRNA的命名遵循以下制订的几个原则［10-11］:①miRNA简写成为miR，根据被克隆出来的先后顺序加上阿拉伯数字，比如miR-125;②将物种缩写置于miR的前面，比如has-miR-125;③高度同源的miRNA在数字后面加上英文小写字母以示区分，比如miR-125a和miR-125b;④根据由不同染色体上的DNA转录而成的具有相同成熟体序列的miRNA，在后面再加上阿拉伯数字，比如miR-125a-1和miR-125a-2;⑤由同一前体的两个臂分别产生的miRNA，根据克隆实验表达水平较低的miR后面加*，例如miR-125a和miR-125a*，或者命名miR-125-5p(表示从5'端的臂上加工而来);⑥在规则确定之前发现的miRNA保留原来的名字，如let-7等。

2 I/R与肺移植

肺移植是临床上治疗终末期肺病的唯一有效手段，目前临床上已经成功实现单肺、双肺以及心肺联合移植。但是，肺移植术后出现I/R是无法避免的一个难题，也是导致手术失败的主要原因之一。I/R对脏器造成的损伤机制极其复杂，包括缺血期损伤和再灌注期损伤;缺血期急性缺氧造成三磷酸腺苷的减少，进而导致细胞内离子紊乱和水解酶激活，造成组织损伤;再灌注过程中组织产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，进而加重组织损伤。ROS是I/R中主要的损伤因子，它在再灌注期损伤中扮演着激活组织中炎性细胞，释放白细胞介素、肿瘤干扰因子等一系列炎性因子，促进组织细胞凋亡，加重组织损伤的角色。肺移植术后早期有15%～20%的移植肺功能发生障碍，而初期发生移植肺功能障碍的主要原因是I/R，发生I/R后肺实质细胞出现凋亡，肺组织出现坏死，临床表现为进行性低氧血症、肺顺应性减小等一系列肺功能障碍。I/R发生的病理生理贯穿于供肺的切取、保存及再灌注的整个过程。为此，人们进行了不懈努力，主要集中于对移植肺有保护作用的物理因素(缺血预处理，氧浓度，胆碱能抗炎通路)及药物上。从分子水平上研究肺组织I/R发生机制研究甚少。I/R的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。寻找发生肺组织I/R的分子机制，可为早期诊断及治疗肺组织发生I/R提供理论基础，甚至可为更深入地了解肺部疾病的发生机制提供研究靶点。

3 miRNA在基因表达中的调控作用

关于miRNA调节细胞增殖的研究有:Bantam是果蝇中一个能抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的miRNA，它可抑制诱导果蝇细胞凋亡的Hid蛋白的表达，从而促进细胞增殖［12］;Chan 等［13］研究表明，miRNA-21在人类恶性胶质瘤中普遍表达，并且通过抑制miRNA-21的表达，恶性胶质瘤细胞数目减少，而且胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7活性增加了3倍，凋亡明显升高。关于miRNA调节细胞凋亡的研究有:Cimmino等［14］发现 miRNA-15a和 miRNA-16-1通过调控Bcl-2蛋白的表达参与细胞的凋亡过程;Alex等［15］研究指出，ROS在缺氧环境下刺激缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和血管内皮生长因子表达上调及缺氧诱导的多种miRNA上调。HIF-1属于在细胞内氧浓度改变而引起的一系列反应中起关键调控作用的转录因子家族成员之一。在缺氧情况下HIF-1降解受阻，合成增多，结果是HIF-1水平上升，转录活性增强。同时指出在缺氧情况下，miR-210、miR-30b、miR-93、miR-181b 的表达水平发生改变，并证实它们是在缺氧情况下调节HIF-1表达的 miRNA。Ivan等［16］指出 miR-210等3种 miRNA在缺氧情况下会发生至少2倍的变化。

4 miRNA与炎性反应

I/R 的基本特征之一是炎性反应，已有多篇文献报道miRNA与免疫、炎性反应之间的关系［17-20］。在实验动物的肺组织中进行的研究有:Moschos等［21］用脂多糖建立小鼠肺部炎症模型，注入脂多糖3 h后用反转录-聚合酶链反应技术从肺中检测到46种 miRNA的表达改变，其中以 miR-21、miR-25、miR-27b、miR-100、miR-140、miR-142-3p、miR-181c、miR-187、miR-194、miR-214、miR-223、miR-224 等 12种miRNA表达上调尤为明显，并与肺部浸润的炎性细胞、细胞因子增多密切相关，提示miRNA在肺部炎性反应种扮演重要的角色。Rodriguez等［22］研究显示，缺乏miR-155的小鼠肺的重构性增强，支气管肺泡中白细胞数量增加，并且检测出炎性刺激时B细胞、T细胞反应减弱和树突状细胞功能下降。这证实了miR-155在调节与T细胞功能相关的基因表达和炎性反应方面有重要作用。Johnnidis等［23］以去除了编码miR-223基因的小鼠为研究对象，观察到了过度成熟的粒细胞表型，对外界刺激的敏感性上调，同时实验显示这些小鼠会产生自发性的肺部炎性反应，在非致死浓度的脂多糖的刺激下即可产生严重的炎性反应组织损伤，提示miR-223在肺组织粒细胞的炎性反应调节中起着重要作用。在人肺泡上皮细胞中的研究有:Perry等［24］研究表明使用白细胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)刺激人肺泡上皮细胞系A549后很快在肺泡上皮细胞中检测到miR-146a和miR-146b这两种miRNA的表达水平上调，但是在支气管上皮细胞中只检测到miR-146a上调;提前用地塞米松处理的组别中仍能检测到miR-146a和miR-146b的表达水平上调，但是其上调水平有所下降。进一步的研究表明抑制miR-146a导致白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)、调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)的释放增加，抑制miR-146b可轻微降低IL-8的产生，对RANTES的影响不甚明显。而 miR-146a、miR-146b对 IL-8和RANTES的mRNA转录水平无影响，提示miR-146a、miR-146b在肺炎性反应中表达上调可能是通过抑制IL-8和RANTES蛋白的翻译过程来调节炎性反应的。

5 miRNA在I/R过程中表达变化的研究进展

5.1 miRNA在脑I/R过程中的表达 Jeyaseelan等［25］在2008年通过构建局灶性脑缺血模型，发现再灌注24 h 和 48 h 后，let-7、miR-7、miR-27a、miR-98、miR-137、miR-204、miR-218、miR-301、miR-338、miR-335、miR-376、miR-424 等下调;miR-210、miR-215、miR-451、miR-497、miR-134等上调，同时研究证实在急性脑缺血早期主要病理变化尚未出现时，miRNA的表达已经发生了明显变化，表明miRNA在神经系统缺血期的病理过程中发挥着重要作用。

5.2 miRNA在肝 I/R过程中的表达 有文献报道［26］通过制作肝I/R模型，发现缺血2 h后miR-223表达水平与丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶含量呈正相关。Xu等［27］随后在缺血预处理后的肝I/R模型中检测到78种miRNA发生了至少2倍差别的变化，其中40种下调、38种上调，与未预处理的肝 I/R 组比较，miR-23a、miR-326、miR-346、miR-370显著表达下调，提示miRNA在肝I/R过程中同样发挥着重要作用。

5.3 miRNA在心肌I/R过程中的表达 Tang等［28］在大鼠心肌I/R模型中发现miR-1与Bcl-2蛋白表达呈负相关，同时在体外实验中证实miR-1在缺氧环境中明显上调，并明确了miR-1的靶基因是Bcl-2。miR-1抑制Bcl-2的蛋白表达，从而在心肌细胞的凋亡中发挥作用。同年，Ren等［29］通过体内外实验发现miR-320在心肌缺血情况下表达显著下调，并发现miR-320过表达时心肌细胞凋亡明显上升。潘振伟等［30］利用手术套管法建立原位大鼠心肌缺血预适应模型发现，建模4 h后I/R区心肌rno-miR-206、btalet-7g、rno-let-7c、rno-let-7f、rno-miR-1 等 5 个 miRNA表达上调，rno-miR-7d* 、rno-miR-193、rno-miR-290、rno-miR-292-5p等4个miRNA表达下调，但是miRNA在心肌I/R过程中的作用值得进一步研究。

5.4 miRNA在肾I/R过程中的表达 吴钰等［31］采用双侧夹闭小鼠肾蒂的方法制造急性I/R肾损伤模型，发现在肾I/R 4 h及24 h后miRNA-92a的表达水平显著上调，同时提示miRNA-92a在缺血性疾病中可以诱导靶向血管相关因子，并且可能参与血管新生的信号途径，促进血管生成，提示miRNA在肾I/R过程中承担重要的角色。

6 结语

miRNA在多种器官组织I/R过程中发挥着重要作用:一部分miRNA可能促进细胞的增殖与分化，另一部分miRNA可能促进细胞的凋亡，加重组织的损伤。随着目前科学技术的不断发展，越来越多的miRNA将不断被发现，哪种miRNA在I/R过程中发挥哪种作用也会得以明确。相信在不久的将来，miRNA可能是早期诊断与治疗I/R及其他相关疾病的非常有效的新靶点之一。

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