造血干细胞体外扩增方法研究进展

余 艳，罗 振(综述)，程腊梅(审校)

(中南大学生殖与干细胞研究所，长沙 410078)

造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)具有高度自我更新、多向分化潜能，能长期重建各系造血和免疫功能。HSCs移植是治疗白血病、再生障碍性贫血、自身免疫性疾病和某些实体瘤(淋巴瘤、乳腺癌等)的有效手段。自1989年首次利用脐血干细胞移植治疗范科尼贫血报道以来，脐血干细胞移植受到了广泛的关注。但由于脐血中HSCs的数量有限，脐血干细胞移植治疗主要应用于儿童和低体质量患者。为满足大龄儿童和成年患者脐血HSCs移植的需求，需通过体外扩增获得足够数量的HSCs。近年来随着分子生物学、遗传学等学科的不断发展，人们对HSCs生物学和造血调节有了更深入的了解，HSCs体外扩增效率得到了极大的提高。

1 添加细胞因子扩增HSCs

将骨髓、外周血或脐血来源的HSCs，置于含有多种细胞因子的培养体系中悬浮培养是早期体外扩增HSCs的主要方法。不同实验室所用细胞因子组合也不尽相同，但是通常都含有干细胞因子(stem cell factor，SCF)、白细胞介素(interleukin，IL)-3、IL-6 和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)，Flt-3/Flk2配体(Flt-3/Flk-2 Ligand， FL)。SCF和FL主要作用造血干/祖细胞，促进造血干/祖细胞分裂和增殖，抑制凋亡［1］;IL-3主要刺激造血祖细胞的增殖和分化［2］;TPO 能够广泛作用于造血细胞的各个阶段，主要调节巨核细胞系的分化［3］。应用上述细胞因子组合扩增HSCs，虽然造血细胞的总数和造血祖细胞数量得到了显著的扩增，但原始HSCs在体外扩增过程中发生分化，扩增后的造血细胞降低了自我更新和重建造血的能力［4］。因此，在扩增HSCs的同时，如何维持干细胞特性是HSCs体外扩增中亟待解决的问题。

近年来，人们对造血微环境的调控作用有了更深入的了解，发现造血微环境中的某些蛋白质对维持HSCs的不分化和自我更新具有重要作用，因此尝试将这些蛋白质用于HSCs的体外扩增。原始HSCs表达Notch信号分子受体，活化Notch信号能抑制HSCs分化，促进HSCs增殖，但是Notch的配体Delta-1在可溶状态下虽能与Notch结合，却不能活化该信号通路［5］。Delaney等［6-7］将 Delta-1 的胞外结构域的编码序列与IgG1的Fc域的编码序列融合，纯化得到Delta-1 ext-IgG;在体外扩增培养时先将Delta-1ext-IgG固定于培养器皿中，固定化的Delta-1 ext-IgG能够激活 HSCs的 Notch信号通路;利用固定化的Delta-1ext-IgG辅以细胞因子 SCF、FL、IL-6、IL-3、TPO扩增HSCs，培养17～21 d，CD34+细胞扩增达222倍，同时造血重建能力增强16倍。

Wnt蛋白是一类分泌型糖蛋白，参与HSCs的自我更新和分化的调节。β连锁蛋白是Wnt信号通路中重要的信号分子，Wnt蛋白与受体结合后抑制β连锁蛋白的磷酸化，导致胞内β连锁蛋白聚集，继而进入细胞核与T细胞因子/淋巴增强因子家族作用，促进特定基因的表达。活化的β连锁蛋白或Wnt1的过量表达能够抑制HSCs分化，促进HSCs的增殖［8］。此外，地诺前列酮也可通过上调β连锁蛋白的表达作用于Wnt信号通路，参与HSCs增殖和分化的调节［9］。

多效蛋白(pleiotrophin，PTN)是在许多组织和细胞系中广泛表达的分泌型肝素结合蛋白，该蛋白不仅调节细胞增殖和迁移，还参与血管的发生。近年研究发现PTN对小鼠HSCs的维持至关重要，同时还能促进人脐血HSCs的体外扩增。Himburg等［10］运用PTN联合细胞因子SCF、FL和TPO扩增人脐血CD34+CD38-细胞，HSCs可扩增近40倍;将扩增后的细胞移植到NOD/SCID小鼠体内，4周后检测到小鼠外周血中人源的细胞数是对照组的3倍，8周后增加至7倍。

2 添加化学分子扩增HSCs

临床研究发现铜离子(Cu2+)在HSCs的发育过程中具有重要的调节作用，Cu2+能使细胞内产生氧化应激，从而影响细胞的增殖、分化和凋亡。体外培养脐血干细胞时，Cu2+能够增加活性氧的浓度，促进HSCs分化;在含有细胞因子(SCF、TPO、FL和 IL-6)的培养体系中加入Cu2+螯合剂四乙烯戊胺(tetraethylenepentamine，TEPA)，CD34+细胞可扩增159倍，为对照组的 3.5 倍［11］。HSCs扩增剂(StemRegenin 1，SR1)是一种嘌呤衍生物，在含SCF、FL和IL-6细胞因子的无血清培养体系中，加入SR1，人脐血CD34+细胞可扩增50倍，SRCs扩增达17倍［12］。

p38是属于细胞分裂素活化蛋白激酶家族信号转导激酶，参与调节多种细胞的分化、衰老和凋亡过程。当内环境稳定时，p38在HSCs的自我更新和正常的造血过程中不发挥作用，但是在氧化应激条件下活化的p38则诱导HSCs衰老［13-14］。SB203580是一种小分子化合物，能够特异性抑制p38的活性。在正常的含氧条件下(21%)p38的活化抑制HSCs的扩增，加入SB203580后，HSCs的扩增效率增加2 倍［15］。

3 基质细胞共培养扩增HSCs

HSCs自我更新、多向分化均依赖于HSCs所处的微环境。微环境中的基质细胞、基质细胞分泌的细胞因子和细胞外基质及造血细胞本身均参与造血稳态的调控。骨髓造血微环境中的基质细胞包括成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、网状细胞、脂肪细胞和间充质细胞，这些基质细胞在体外对HSCs均有不同程度的扩增作用［16］。Kawano等［17］将人端粒末端转移酶催化亚基转染人骨髓基质细胞建立基质细胞系，支持脐血CD34+细胞体外增殖。骨髓间充质干细胞也具有扩增HSC/HPC的作用，脐血单个核细胞与充质细胞共培养14 d，CD133+细胞和CD34+细胞可分别扩增30倍和8倍，集落形成单位扩增约200倍［18］。小鼠骨髓基质细胞来源的OP9细胞系转染Delta-1基因后，在扩增造血HSCs的同时，能有效地促进CD34+CD38-Lin-的自我更新［19］。此外，内皮细胞(endothelial cells，ECs)也能有效促进HSCs的体外扩增。在共培养体系中，ECs表达的Notch配体，激活HSCs的 Notch信号，抑制 HSCs的分化，促进HSCs增殖的同时能保持HSCs的自我更新潜能［20］。转染了E4ORF1基因的ECs(E4ORF1+ECs)能够在无血清和细胞因子的条件下长期培养［21］。为了排除ECs生长所需的生长因子对HSCs扩增的影响，Butler等［20］利用 E4ORF1+ECs与 HSCs在无血清和细胞因子的情况下进行共培养，扩增后的HSCs能够长期植入所有的受体小鼠体内。基质细胞共培养较单纯用细胞因子的培养体系，扩增HSCs的效率更高，但共培养体系成分复杂，影响因素较多，不便于大规模的扩增培养和标准化，并且异体的基质细胞有排斥和传播疾病的风险，不适合临床上的应用。

4 HSC基因修饰

SALL4是一种新发现的含锌指结构的转录因子，对胚胎干细胞多能性的维持至关重要［22］。SALL4在人白血病细胞系和早期急性髓性白血病细胞中表达，可能与正常HSCs的自我更新有关［23-24］。SALL4基因过表达的CD34+细胞在体外扩增培养2个月后，HSC扩增可达10 000～15 000倍，并且植入能力和长期重建造血能力均得到显著增强［25］。

除了HSCs体外扩增效率外，HSCs的植入率也是影响HSCs移植成功与否的关键。CD34+细胞过表达CXCR4基因，能够增强基质细胞衍生因子1介导的趋化作用，增加HSCs移植后的植入率，提高HSCs移植的成功率［26］。

5 其他方法

骨髓血液中的氧张力较其他组织低，相当于颈静脉血的氧张力［27］。细胞周期缓慢的HSCs趋向于定植在远离血管的低氧区，细胞周期活跃的HSCs位于血管附近的区域［28］。低氧条件培养CD34+细胞能够提高其植入后造血重建能力［29］。低氧环境中的HSCs保持低的扩增速率避免氧化应激的损伤，并且能够表达更高水平的Notch-1、端粒酶和细胞周期抑制因子 p21［30］。

纳米纤维是一种能渗透的纤维，具有可控制的拓扑特性，这种结构能够显著提高表面积与体积比。以纳米纤维作为支架材料，模拟体内造血微环境结构扩增HSCs，能明显提高HSCs的扩增效率。将网状的纳米纤维材料黏附于24孔培养板底部，将脐血来源的CD133+细胞加入到纳米材料制成的支架上进行扩增培养，扩增培养10 d后细胞总数增加了225倍，并且仍高表达 CD133(24%)和 CD34(93%)［31］。近年来用旋转的生物反应器来扩增培养HSC，细胞数可扩增435倍，CD34+细胞扩增 30 余倍［32］。生物反应器的利用避免了共培养异体基质细胞疾病传播的风险，降低了成本，具有极大的应用价值。

6 展望

进一步优化HSCs扩增培养体系，提高HSCs的扩增效率，为临床移植治疗提供充足的HSCs，需要更加深入地研究HSCs增殖、分化机制，寻找最佳的细胞因子组合，并利用生物工程技术，建立更加优化的大规模培养装置。另外，可通过寻找新的HSCs来源，以满足日益增长的HSCs需求，例如利用胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞在体外向造血定向诱导分化。此外，扩增的HSCs用于临床前还需要进行大量的随机临床试验，以验证其安全性和有效性。随着干细胞领域研究的不断发展，移植技术的不断完善，扩增的脐血HSCs将更加广泛地应用于临床治疗中。

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